Imagiologia estruturas celulares no embrião vivo Zebrafish

Na imagem in vivo proporciona a visualização direta de comportamentos celulares no contexto mais fisiológica. A transparência de embriões de peixe-zebra, o seu desenvolvimento rápido e externa e uma rica variedade de ferramentas genéticas que permitem a marcação fluorescente têm contribuído para o crescente uso de microscopia in vivo para elucidar a dinâmica dos eventos fundamentais de desenvolvimento. Estudos de imagem do desenvolvimento do sistema nervoso no peixe-zebra tem, por exemplo, expandiu enormemente o nosso conhecimento do comportamento das células progenitoras neurais eo destino de seus descendentes, incluindo a sua subseqüente migração, diferenciação e integração de circuitos ^1-8.

O palco já está definido para investigar a dinâmica subcelulares subjacentes a esses comportamentos celulares. De fato, peixe-zebra já estão sendo exploradas como ferramentas para a biologia celular vivo. Agora é possível visualizar mitocôndrias ^9-11, centrossomas ^2,8,12-14, Golgi ¹⁵, O citoesqueleto de microtúbulos ⁴ e actina ^16, endossomas e ¹⁷ componentes da membrana apical ^1,18 complexo, entre outras estruturas subcelulares em embriões de peixe-zebra in vivo. Até agora, muito do que se sabe sobre a função destes organelos vem do estudo do seu comportamento em células em cultura. Embora estudos in vitro produziram tremenda visão sobre biologia celular, células em cultura não representa totalmente a complexidade da situação in vivo e, portanto, não refletem necessariamente a função e dinâmica de organelos subcelulares in vivo. Embriões de peixe-zebra oferecer uma alternativa viável em alternativa vivo para examinar a dinâmica subcelulares.

Como vertebrados, peixe-zebra possuem diversos sistemas de órgãos (por exemplo, retina neural) que são homólogos aos encontrados em espécies de mamíferos. Para além disso, os embriões de peixe-zebra são cada vez mais utilizadas para modelar doenças humanas ^19,20 </sup>, incluindo os relacionados com a função centrosomal (por exemplo, microcefalia ²¹ e amaurose ²² congênita de Leber) e função mitocondrial (por exemplo, doença de Parkinson ^23, Tauopatias ^10,24 e síndrome de Barth ^25). imagiologia in vivo a nível celular e subcelular nestes casos irá permitir uma melhor compreensão da biologia celular subjacente a estes estados patológicos.

O objetivo geral dos métodos descritos aqui é fornecer um guia completo para investigar organelas e outras estruturas subcelulares em embriões de peixe-zebra usando em microscopia de luz vivo. O todo o fluxo de trabalho envolvido na visualização e rastreamento estruturas subcelulares in vivo é descrito – a partir de rotulagem abordagens genéticas, para gerar expressam transitoriamente e peixes transgénicos estáveis, e, finalmente, para imagiologia utilizando de campo amplo e microscopia confocal. Enquanto cada um destes Procedures é utilizado por numerosos laboratórios de peixe-zebra, os protocolos descritos são otimizados e simplificado para investigar a dinâmica das estruturas subcelulares. Dois aspectos específicos do trabalho aqui descrito garante menção: Em primeiro lugar, a utilização do sistema de expressão de Gal4 UAS-em múltiplas configurações geneticamente organelos etiqueta integrada tipos de células específicos. Em segundo lugar, uma comparação directa de grande campo e microscopia confocal a estruturas subcelulares de imagem in vivo.

As estratégias actuais geneticamente organelos de etiquetas e de outras estruturas subcelulares no peixe-zebra, quer fazer uso de ARNm tampado ^1,4,8 ou construções de ADN com base em elementos promotores conduzir directamente a expressão de proteínas de fusão ^9,14,15. Transcrito in vitro de ARN em tampado resultados rápida e expressão ampla, que não é específico do tecido entanto. Além disso, os níveis de expressão diminuir ao longo do tempo, como o RNA tampado é diluído ou degradados. Assim, o uso de ARN baseadoconstrói para examinar a dinâmica de organelos em fases posteriores do desenvolvimento é limitado (geralmente até 3 dias pós-fertilização).

Estas limitações podem ser superadas utilizando construções de ADN, em que o controlo espacial e temporal de expressão é determinada por elementos promotores específicos. Quando construções de ADN com base são utilizados no contexto do sistema Gal4-UAS melhorias significativas para os níveis de expressão do transgene são observados ^26,27. Neste sistema de expressão bipartido, de tipo célula elementos promotores específicos dirigir a expressão de um activador transcricional Gal4, enquanto que os genes repórter são clonados a jusante da sequência de activação a montante Gal4 de ligação (UAS). Através da combinação de UAS de Gal4 repórteres com condutores apropriados, a expressão pode ser restringida a tipos específicos de células, evitando a necessidade de clonar genes repórter diferentes promotores para trás cada vez que é desejado um padrão de expressão específico. Além disso, a expressão de vários genes repórter pode ser UAScomandado por um único activador Gal4. O sistema Gal4-UAS proporciona, assim, uma abordagem genética versátil e flexível para a rotulagem subcelular.

Wide-campo e microscopia confocal são os burros de carga da maioria dos laboratórios. sistemas de campo amplo tipicamente usam uma lâmpada de arco como uma fonte de luz e detectar a luz emitida com uma câmara sensível que é colocado na extremidade do percurso de luz. Esta modalidade de imagem é normalmente restrito a amostras finas como fora de foco de luz obscurece a informação em foco em amostras mais espessas. Microscópios confocal diferem dos sistemas de campo amplo, na medida em que são construídos para favorecer os sinais que se originam a partir do plano focal sobre aqueles que se originam fora de foco (ou seja, "seccionamento óptico") ^28. Para atingir o seccionamento de um orifício óptico é colocado no caminho de emissão em posição conjugada com a fonte de luz pontual. Os lasers são usados ​​como fontes de luz e os sinais são detectados com tubos fotomultiplicadores (PMTs). Praticamente, um laserfeixe é passado através da amostra de ponto-a-ponto e a emissão de fluorescência em cada ponto (pixel) é detectada pelo PMT.

Aqui nós imagem as mesmas estruturas subcelulares em viver embriões de peixe-zebra usando tanto de campo amplo e microscopia confocal para proporcionar uma comparação directa de ambas as modalidades de microscopia. O objectivo subjacente de fornecer tais comparações é oferecer diretrizes para a escolha da técnica de microscopia mais apropriado para a questão específica na mão.

Usando as abordagens descritas aqui demonstramos Gal4-UAS base rotulagem genética das mitocôndrias e centrossomas. Essas organelas são gravadas em diferentes tipos de células do sistema nervoso e em células musculares utilizando todo o campo e microscopia confocal para demonstrar a adequação de cada modalidade de imagem. Os métodos descritos aqui podem ser facilmente adaptado para a investigação de outros organelos e estruturas subcelulares no embrião do peixe-zebra vivos.