Imagerie Structures subcellulaires dans le Embryo Living Zebrafish

L'imagerie in vivo fournit une visualisation directe des comportements cellulaires dans le contexte le plus physiologique. La transparence des embryons de poisson zèbre, leur développement rapide et externe et un riche éventail d'outils génétiques qui permettent l' étiquetage fluorescent ont tous contribué à l'utilisation croissante de la microscopie in vivo pour élucider la dynamique des événements clés du développement. Les études d'imagerie de développement du système nerveux chez le poisson zèbre ont par exemple considérablement élargi notre connaissance du comportement des cellules progénitrices neurales et le sort de leur progéniture , y compris leur migration ultérieure, la différenciation et l' intégration du circuit ^1-8.

Le décor est désormais planté pour étudier la dynamique subcellulaire qui sous-tendent ces comportements cellulaires. En effet, le poisson zèbre sont déjà exploitées comme des outils pour in vivo la biologie cellulaire. Il est maintenant possible de visualiser les mitochondries ^9-11, centrosomes ^2,8,12-14, Golgi ¹⁵Le cytosquelette d' actine et microtubules ^{4 16, 17} endosomes et les composants de la membrane apicale complexe ^1,18, entre autres structures sous – cellulaires dans les embryons de poisson zèbre in vivo. Jusqu'à présent, une grande partie de ce qui est connu sur la fonction de ces organites vient d'étudier leur comportement dans les cellules cultivées. Bien que des études in vitro ont donné un remarquable aperçu de la biologie cellulaire, les cellules en culture ne représentent pas pleinement la complexité de la situation in vivo et ne reflètent donc pas nécessairement la fonction et la dynamique des organites intracellulaires in vivo. Embryons de poisson zèbre offrent une solution viable en alternative vivo d'étudier la dynamique subcellulaire.

Comme les vertébrés, le poisson – zèbre possède de nombreux systèmes d'organes (par exemple, la rétine neurale) qui sont homologues à celles trouvées chez les espèces de mammifères. En outre, les embryons de poisson zèbre sont de plus en plus utilisés pour modéliser les maladies humaines ^19,20 </sup>, y compris ceux qui sont liés à la fonction centrosomale (par exemple, microcéphalie ²¹ et amaurose ²² congénitale de Leber) et de la fonction mitochondriale (par exemple, la maladie de Parkinson ^23, tauopathies ^10,24 et le syndrome de Barth ^25). imagerie in vivo au niveau cellulaire et subcellulaire dans ces cas, permettra une meilleure compréhension de la biologie des cellules sous-jacentes de ces états pathologiques.

L'objectif général des méthodes décrites ici est de fournir un guide complet pour enquêter sur les organites et d' autres structures subcellulaires dans les embryons de poisson zèbre en utilisant la microscopie optique in vivo. L'ensemble du flux de travail impliqués dans la visualisation et le suivi des structures intracellulaires in vivo est décrit – des approches d'étiquetage génétiques, de générer transitoirement exprimer et de poissons transgéniques stables, et enfin à l' imagerie utilisant grand champ et la microscopie confocale. Bien que chacun de ces procedures est utilisé par de nombreux laboratoires de poisson zèbre, les protocoles décrits sont optimisés et rationalisés pour étudier la dynamique des structures subcellulaires. Deux aspects spécifiques des travaux décrits ici méritent mention: Tout d'abord, l'utilisation du système d'expression Gal4-UAS dans de multiples configurations pour génétiquement organites d'étiquettes dans types cellulaires spécifiques. Deuxièmement, une comparaison directe de grand champ et la microscopie confocale à des structures subcellulaires d'image in vivo.

Les stratégies actuelles pour modifier génétiquement des organites d'étiquettes et autres structures sous – cellulaires chez le poisson zèbre , soit utiliser des ARNm coiffés ^1,4,8 ou des constructions d'ADN sur la base , où les éléments promoteurs entraînent directement l'expression des protéines de fusion ^9,14,15 transcrit in vitro coiffé résultats d'ARN in. rapide et large expression, ce n'est pas spécifique du tissu cependant. En outre, les niveaux d'expression diminuent au fil du temps que l'ARN coiffé est dilué ou dégradé. Ainsi, l'utilisation d'ARN à base deconstruit pour examiner la dynamique des organites à des stades ultérieurs de développement est limitée (généralement jusqu'à 3 jours après la fécondation).

Ces limitations peuvent être surmontées en utilisant des constructions d'ADN, où le contrôle spatial et temporel d'expression est déterminé par des éléments spécifiques du promoteur. Quand les constructions d'ADN sur la base sont utilisés dans le contexte du système Gal4-UAS des améliorations significatives des niveaux d'expression du transgène sont observées ^26,27. Dans ce système d'expression bipartite éléments promoteurs spécifiques du type cellulaire conduisent l'expression d'un activateur de transcription de Gal4, tandis que les gènes rapporteurs sont clonés en aval de la séquence d'activation en amont Gal4 de liaison (UAS). En combinant UAS journalistes avec les pilotes Gal4 appropriés, l'expression peut être limitée aux types cellulaires spécifiques, contourner la nécessité de cloner des gènes rapporteurs derrière des promoteurs différents à chaque fois un motif d'expression spécifique est souhaitée. En outre, l'expression de multiples gènes rapporteurs UAS peut êtreentraînés par un seul activateur de Gal4. Le système Gal4-UAS fournit donc une approche génétique polyvalent et flexible pour l'étiquetage subcellulaire.

Grand champ et microscopes confocaux sont les chevaux de bataille de la plupart des laboratoires. Les systèmes à grand champ utilisent généralement une lampe à arc en tant que source de lumière et détecter la lumière émise par une caméra sensible qui est placé à l'extrémité du trajet lumineux. Cette modalité d'imagerie est généralement limitée à des échantillons minces comme hors de la lumière de mise au point obscurcit les informations de mise au point dans des échantillons plus épais. Microscopes confocale diffèrent des systèmes à champ large en ce qu'ils sont construits pour favoriser les signaux qui proviennent du plan focal par rapport à ceux qui sont originaires de mise au point ( par exemple, «sectionnement optique») ^28. Pour réaliser un sectionnement optique à sténopé est placée dans le chemin d'émission dans une position conjuguée à la source de lumière ponctuelle. Les lasers sont utilisés en tant que sources de lumière et les signaux sont détectés avec des tubes photomultiplicateurs (PMT). Pratiquement, un laserfaisceau est glissée sur l'échantillon point par point et l'émission de fluorescence à chaque point (pixel) est détecté par le PMT.

Ici, nous l'image les mêmes structures subcellulaires dans la vie des embryons de poisson zèbre utilisant à la fois grand champ et la microscopie confocale pour fournir une comparaison directe des deux modalités de microscopie. L'objectif sous-jacent de fournir de telles comparaisons est d'offrir des lignes directrices pour le choix technique de microscopie la plus appropriée pour la question spécifique à portée de main.

En utilisant les approches décrites ici, nous démontrons Gal4-UAS étiquetage génétique basée des mitochondries et centrosomes. Ces organites sont imagés dans différents types de cellules du système nerveux et dans les cellules musculaires en utilisant grand champ et la microscopie confocale à démontrer la pertinence de chaque modalité d'imagerie. Les méthodes décrites ici peuvent être facilement adaptés pour enquêter sur d'autres organites et des structures subcellulaires dans l'embryon de poisson zèbre vivant.