Мышь наивного CD4⁺ Т-клеток Выделение и<em> В пробирке</em> Дифференциация в Т-клеточных подмножеств

Концепция различных линий или подмножеств CD4 ⁺ Т-хелперов (Th) клетки была примерно со второй половины ^20-го века ^1. Распознавание антигеном в присутствии костимуляторных сигналов приводит в нескольких раундах клеточной пролиферации и дифференцировки в конечном итоге в эффектора Th-клеток. Тип Th клетки, генерируемого в ходе этого процесса зависит от окружающей среды цитокинов, присутствующих во время активации ^2. Первоначально наивные Th клетки думал поляризовать в 2 различных линий следующих T-клеточного рецептора (TCR) активации, костимулирующего CD28 перевязки и цитокинов сигнализации. Тип 1-хелперы (Th1) характеризуются эффекторной производства цитокина IFN & gamma; а также их потребности в ИЛ-12 сигнализации в процессе дифференциации ^3,4. В конце концов выяснилось, что дифференцированные клетки Th1 имеют генетический профиль, который наиболее отчетливо характеризуется бу выражение T коробки фактора семья транскрипции, Tbx21 (T-бет), который считается мастером регулятором генетической программы Th1 ^5. Кроме того, ИЛ-12, а также может способствовать IFN & gamma; Т-прогноз выражение ^6,7. В иммунного ответа, Th1-клетки играют важную роль в защите организма против внутриклеточных патогенов, а также сильных промоторов аутоиммунного воспалительного процесса. В отличие от этого, тип 2-хелперы (Th2) требуют IL-4 по их развитием и эффекторные цитокины, включая IL-4, IL-5 и IL-13, имеют важное значение для приведения ответов В-клеточные и являются патогенными при аллергии ^{8, 9.} Как Th1 клеток, Th2 клетки были обнаружены, чтобы выразить свою собственную регулятор мастер транскрипции, называют GATA-3 ^10,11. Интересно, что присутствие поляризующих цитокинов и генерации конкретного Th линии являются антагонистами к развитию других ^2,12, предполагая, что только подмножество частности че может стать доминирующим в ходе иммунного ReОтклик.

Поскольку идентификации клонов Th1 и Th2, дальнейшая работа показала, еще более уникальным подмножества Т-хелперных клеток, в том числе фолликулярной помощника (TFH), IL-9-продуцирующих (Th9), и IL-22-продуцирующие (Th22) (последнее рассмотрены в ^13). Для целей в пробирке экспериментов дифференциации, этот протокол будет сосредоточена только на два дополнительных Th подмножества, называемые регуляторные Т-клетки (Treg) и Ил-17 по производству CD4 ⁺ Т-клетки (TH17). CD25 ⁺ регуляторных Т-клеток может происходить естественным (nTreg) в тимусе; Наивные клетки Th также могут быть вызваны (iTreg), чтобы стать регулирования на периферии (обзор ^14,15). Оба типа регуляторных Т-клеток выразить характеристика транскрипционный фактор, названный forkhead P3 коробка (FOXP3), которая имеет решающее значение для их эффекторных механизмов подавления, которые включают растворимые противовоспалительное производства посредника, IL-2 потребления, а ячейку контактно-зависимые механизмы ^14,15. Отсутствие Foxp3 Результаты выражение в тяжелой, полиорганной аутоиммунных расстройств называется иммунной нарушения, так polyendocrinopathy, энтеропатия, с Х-хромосомой синдром (IPEX), что свидетельствует о критической роли этого Th подмножества в решении воспаление и регулирования периферической толерантности к собственным антигенам ^16. В пробирке, наивные CD4 ⁺ Т-хелперы до регулировать Foxp3 и стать привержены программы Treg при стимуляции IL-2 и TGF-β ^14,15. Там может быть умеренной до значительной пластичности в CD4 ⁺ Т-клеточных поколений, особенно при рассмотрении только продукцию цитокинов (обзор в ^17,18). Тем не менее, для целей в пробирке протоколов дифференциации, мы будем обсуждать каждое из подмножеств как уникального рода.

Недавно подмножество Th17 клеток, которые производит цитокин IL-17 была определена в качестве уникального линии с про-воспалительных функций, особенно патогенные во время аутоиммунного воспаления ^19-21, Th17 клетки экспрессируют уникальный транскрипционный фактор, названный ретиноидов, связанные с гамма-рецептор сирота т (RORγt), который координирует генетическую программу ²² Th17. TGF-beta является важным для генерации Th17 линии через индукции RORγt. Тем не менее, влияние сигналов TGF-beta, как полагают, вызывают только Th17 приверженность при синергизма с IL-6 (обзор в ^12). Дальнейшие исследования показали, что множество других сигналов, которые могут положительно регулируют Th17 приверженность, в том числе ИЛ-1β, увеличение натрия и TLR сигнализации ^23-26. Другие отчеты предполагают, что патогенные клетки Th17 в естественных условиях являются те, которые фактически обходить сигнализации TGF-beta, а вместо этого полагаются на сочетание ИЛ-1, ИЛ-6 и ИЛ-23 для их дифференциации ^27. Таким образом, Th17 клетки могут быть получены из различных сигнальных путей; для целей настоящего протокола, часто используемых (TGF-beta и IL-6) путь для Th17 коммитированиебудут представлены.

Протоколы дифференцирования, описанные ниже, для всех эффекторных линий зависит от фиксированного антитела, стимулов для TCR и CD28 на протяжении всего хода эксперимента. Тем не менее, другие показали, что TCR-активации с антиген-представляющих клеток ²⁸ или сшивающий анти-CD3 и анти-CD28 антител с антителом хомячка в течение 2 дней ²⁹ также весьма эффективным средством индукции генерацию различных Th подмножеств. Протокол, представленные здесь основывается на ранее сообщалось о способах выделения мышиных CD4 ⁺ Т-клеток из вторичных лимфоидных органов ³⁰ и генерации клетки Th17 ^31. Одним из основных отличий является то, что этот протокол основан на использовании клеточного сортера, чтобы изолировать наивных CD4 ⁺ Т-клеток от лимфоидных тканей. Тем не менее, многие компании сейчас предлагают для экспресс разделения, который может обогатить для простых CD4 ⁺ Т-клеток, которые могут быть в состоянии обойти требование пили сортировки в зависимости от эксперимента. Методы и реагенты, представленные в этом протоколе то, что мы обычно используем и нахожу, чтобы быть наиболее эффективным. Однако, имейте в виду, что альтернативные реагенты и методологии существуют для многих из шагов, представленных ниже, и это до индивидуального лаборатории, чтобы определить, что будет работать лучше для своих целей.