Summary

Rato Naïve CD4<sup> +</sup> Isolamento de células T e<em> In vitro</em> Diferenciação em subpopulações de células T

Published: April 16, 2015
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Summary

Naïve CD4+ T cells polarize to various subsets depending on the environment at the time of activation. The differentiation of naïve CD4+ T cells to various effector subsets can be achieved in vitro through the addition of T cell receptor stimuli and specific cytokine signals.

Abstract

Antigen inexperienced (naïve) CD4+ T cells undergo expansion and differentiation to effector subsets at the time of T cell receptor (TCR) recognition of cognate antigen presented on MHC class II. The cytokine signals present in the environment at the time of TCR activation are a major factor in determining the effector fate of a naïve CD4+ T cell. Although the cytokine environment during naïve T cell activation may be complex and involve both redundant and opposing signals in vivo, the addition of various cytokine combinations during naive CD4+ T cell activation in vitro can readily promote the establishment of effector T helper lineages with hallmark cytokine and transcription factor expression. Such differentiation experiments are commonly used as a first step for the evaluation of targets believed to promote or inhibit the development of certain CD4+ T helper subsets. The addition of mediators, such as signaling agonists, antagonists, or other cytokines, during the differentiation process can also be used to study the influence of a particular target on T cell differentiation. Here, we describe a basic protocol for the isolation of naïve T cells from mouse and the subsequent steps necessary for polarizing naïve cells to various T helper effector lineages in vitro.

Introduction

O conceito de linhagens distintas ou subconjuntos de CD4 + T helper (Th) tem sido em torno desde a última parte do século 20 1. O reconhecimento de antigénio correspondente na presença de sinais co-estimuladores resultados em diversas fases da proliferação celular e da eventual diferenciação em células Th efectoras. O tipo de célula Th gerada durante este processo é dependente do ambiente citoquina presente durante a activação 2. Inicialmente, as células Th simples foram pensados ​​para polarizar em duas linhagens distintas seguintes receptor de células T (TCR) de activação, ligação co-estimulador CD28, e sinalização de citocina. Tipo 1 células auxiliares (Th1) são caracterizadas pela sua produção efectora da citoquina IFN-y, bem como a sua exigência de sinalização de IL-12 durante o processo de diferenciação 3,4. Finalmente, foi descoberto que as células Th1 diferenciadas têm um perfil genético que é distintamente mais caracterizada by a expressão do factor de transcrição da família T box, Tbx21 (T-bet), o qual é considerado o principal regulador do programa genético Th1 5. Além disso, a IL-12, bem como de IFN-y pode promover a expressão de T-bet 6,7. Na resposta imune, as células Th1 são importantes para a defesa do hospedeiro contra agentes patogénicos intracelulares, bem como promotores fortes de inflamação auto-imune. Em contraste, as células auxiliares do tipo 2 (Th2) IL-4 requerem para o seu desenvolvimento e suas citocinas efectoras, incluindo IL-4, IL-5 e IL-13, são importantes para dirigir as respostas das células B e são patogénicas em alergia 8, 9. Semelhante a células Th1, Th2 foram encontrados para expressar seu próprio regulador mestre da transcrição, denominada GATA-3 10,11. Interessantemente, a presença de citocinas polarizadoras e a geração de uma linhagem Th são antagonistas específicos para o desenvolvimento de outros 2,12, sugerindo que apenas um subconjunto Th particular pode tornar-se dominante durante uma re imunerespos-.

Desde a identificação das linhagens Th1 e Th2, a continuação dos trabalhos demonstrou ainda mais exclusivos subconjuntos de células T auxiliares, incluindo folicular auxiliar (TFH), IL-9, produzindo-(Th9), e IL-22 produtoras (Th22) (recentemente revisto em 13). Para efeitos de experiências in vitro de diferenciação, este protocolo vai se concentrar apenas em dois subconjuntos Th adicionais, chamadas de células T reguladoras (Tregs) e IL-17 produzindo células-T CD4 + (Th17). CD25 + células T reguladoras pode ocorrer naturalmente (nTreg) no timo; células Th simples pode também ser induzida (iTreg) para se tornar reguladora na periferia (revisto em 14,15). Ambos os tipos de Tregs expressar um factor de transcrição característica, denominado forkhead caixa P3 (Foxp3), o qual é crítico para as suas mecanismos efectores que incluem supressão de produção solúvel anti-inflamatória mediador, IL-2 consumo, e os mecanismos de células dependentes de contacto 14,15. A falta de Foxp3 resultados de expressão em um multi-órgãos distúrbio grave, auto-imune denominado alteração no sistema imunológico, poliendocrinopatia, enteropatia, síndrome do X-linked (IPEX), demonstrando o papel fundamental deste subconjunto Th na resolução de inflamação e regulação tolerância periférica à auto antígenos 16. In vitro, as células T helper CD4 + naive-regulam Foxp3 e tornar-se comprometida com o programa Treg após estimulação com IL-2 e TGF-β 14,15. Não pode ser moderada a plasticidade considerável em linhagens de células CD4 + T, especialmente quando se considera apenas a produção de citocinas (revisto em 17,18). No entanto, para efeitos de protocolos de diferenciação in vitro, vamos discutir cada subconjunto como uma linhagem única.

Recentemente, um subconjunto de células Th17, que produz a citocina IL-17 foi identificada como uma linhagem original com funções pró-inflamatórias que são particularmente patogénico durante a inflamação autoimune 19-21. Células Th17 expressar um fator de transcrição original, denominado dependente do retinóide gamma receptor órfão t (RORγt), que coordena o programa genético Th17 22. TGFp é importante para a geração de Th17 linhagem através da indução de RORγt. No entanto, se acredita que o efeito de sinalização de TGF-p para induzir apenas Th17 compromisso sobre sinergia com IL-6 (revisto em 12). Outros estudos têm mostrado que uma variedade de outros sinais que podem regular positivamente Th17 compromisso, incluindo IL-1β, o aumento de sódio, e de sinalização de TLR 23-26. Outros relatos sugeriram que as células Th17 patogénicos in vivo são os que realmente desviam a sinalização TGF-p e em vez disso dependem de uma combinação de IL-1, IL-6, e IL-23 para a diferenciação 27. Assim, as células Th17 pode ser derivado de uma variedade de vias de sinalização; para efeitos do presente protocolo, o comumente usado (TGF e IL-6) via para Th17 compromisso linhagemirá ser apresentada.

Os protocolos de diferenciação descritos abaixo para todas as linhagens efectoras depende de anticorpo fixa como estímulos para o TCR e CD28 ao longo de todo o decurso da experiência. No entanto, outros autores demonstraram que a activação de TCR com células apresentadoras de antigénio ou 28 anti-CD3 e anti-CD28 com anticorpo de hamster de ligação cruzada durante 2 dias 29 também são meios altamente eficazes de induzir a produção de vários subconjuntos Th. O protocolo aqui apresentado baseia-se em métodos reportados anteriormente para isolar as células CD4 + T murino de órgãos linfóides secundários 30 e geração de células Th17 31. Uma diferença importante é que este protocolo baseia-se na utilização de um separador de células para isolar as células T CD4 + naive a partir de tecidos linfóides. No entanto, muitas empresas já oferecem kits de separação rápidas que podem enriquecer as células T CD4 + naïve, que pode ser capaz de contornar a exigência de fou classificação, dependendo da experiência. Os métodos e reagentes apresentados neste protocolo são o que nós rotineiramente usar e encontrar para ser o mais eficaz. No entanto, tenha em mente que existem reagentes alternativos e metodologias para muitos dos passos apresentados a seguir e cabe ao laboratório indivíduo para determinar o que funcionará melhor para seus propósitos.

Protocol

Todos os procedimentos experimentais são realizados usando protocolos aprovados pelo escritório de Saúde e Segurança Ambiental da Rosalind Franklin Universidade de Medicina e Ciência. Murganhos C57BL / 6 (adquirido a partir de NCI) utilizado para este protocolo foram alojados sob condições isentas de patogénios específicos, e todas as experiências com animais foram realizadas usando protocolos aprovados pelo Comité de Cuidados e Uso de Animais Institucional (IACUC) no Rosalind Franklin Universidade de Medicin…

Representative Results

O ponto de tempo para a análise de diferenciação pode variar dependendo da condição a ser testado Th, bem como a força de activação do receptor de células T. Depois de 2-3 dias de diferenciação, as células podem ser visualizados por microscopia óptica para determinar a extensão da proliferação de células T. Wells expositoras extensa proliferação e aglomeração de células provavelmente estará pronto para análise no dia 4. condições de diferenciação contando com a adição de IL-2, tais como Th1…

Discussion

Enquanto o baço contém células Th simples, a proporção da população nos nódulos linfáticos é muito maior. Falha em identificar corretamente e remover os linfonodos neste protocolo irá resultar em um fraco rendimento de células naïve. Isto pode ser especialmente difícil nos ratos mais velhos ou ratinhos macho que têm mais tecido gordo. Como mostrado na Figura 1, a fixação adequada e de membros de pinagem animais e pele irá permitir a fácil visualização dos nódulos linfáticos exteri…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Os autores gostariam de agradecer a todos os membros do laboratório de Reynolds em Rosalind Franklin Universidade de Medicina e Ciência, e o laboratório Chen Dong da Universidade do Texas MD Anderson Cancer Center, para a otimização do presente protocolo. Este trabalho foi financiado por uma doação para JMR do National Institutes of Health (K22AI104941).

Materials

Complete RPMI: Warm in a 37 oC water bath before use
RPMI 1640 Media Life Technologies 11875119
10 % FBS Life Technologies 26140-079
1000X 2-mercaptoethanol Life Technologies 21985023
100X Pen/Strep Life Technologies 15140122
100X L-glutamine Life Technologies 25030081
120 micron nylon mesh Amazon CMN-0120-10YD Cut into 2 cm2 squares and autoclave
Alternative: 100 micron cell strainers Fisher 08-771-19 Alternative to cutting nylon mesh
autoMACS running buffer Miltenyi 130-091-221 Warm in a 37 oC water bath before use
autoMACS rinsing solution Miltenyi 130-091-222 Warm in a 37 oC water bath before use
CD4 beads Miltenyi 130-049-201
ACK lysis buffer Life Technologies A10492-01
Cytokines:
Human (h) IL-2 Peprotech 200-02
Recombinant mouse (rm) IL-4 Peprotech 214-14
rmIL-6 R & D Systems 406-ML-025
rmIL-12 Peprotech 210-12
hTGFb R & D Systems 240-B-010
Antibodies:
2C11 (anti-CD3) BioXcell BE0001-1
37.51 (anti-CD28) BioXcell BE0015-1
11B11 (anti-IL-4) BioXcell BE0045
XMG1.2 (anti-IFNg) BioXcell BE0055
anti-CD62L-FITC BioLegend 104406 Use at 1:100
anti-CD25-PE BioLegend 102008 Use at 1:400
anti-CD4-PerCP BioLegend 100434 Use at 1:1000
anti-CD44-APC BioLegend 103012 Use at 1:500
Phorbol  12-myristate 13 acetate (PMA) Sigma-Aldrich P-8139 Prepare a stock at 0.1 mg/ml in DMSO and freeze aliquots at -20 oC
Ionomycin Sigma-Aldrich I-0634 Prepare a stock at 0.5 mg/ml in DMSO and freeze aliquots at -20 oC
Brefeldin A eBioscience 00-4506-51 Use at 1:1000

References

  1. Mosmann, T. R., Cherwinski, H., Bond, M. W., Giedlin, M. A., Coffman, R. L. Two types of murine helper T cell clone. I. Definition according to profiles of lymphokine activities and secreted proteins. J Immunol. 136 (7), 2348-2357 (1986).
  2. Dong, C., Flavell, R. A. Cell fate decision: T-helper 1 and 2 subsets in immune responses. Arthritis Res. 2 (3), 179-188 (2000).
  3. Hsieh, C. S., et al. Development of TH1 CD4+ T cells through IL-12 produced by Listeria-induced macrophages. Science. 260 (5107), 547-549 (1993).
  4. Seder, R. A., Gazzinelli, R., Sher, A., Paul, W. E. Interleukin 12 acts directly on CD4+ T cells to enhance priming for interferon gamma production and diminishes interleukin 4 inhibition of such priming. Proc Natl Acad Sci U S A. 90 (21), 10188-10192 (1993).
  5. Szabo, S. J., et al. A novel transcription factor, T-bet, directs Th1 lineage commitment. Cell. 100 (6), 655-669 (2000).
  6. Afkarian, M., et al. T-bet is a STAT1-induced regulator of IL-12R expression in naive CD4. T cells. Nat Immunol. 3 (6), 549-557 (2002).
  7. Zhu, J., et al. The transcription factor T-bet is induced by multiple pathways and prevents an endogenous Th2 cell program during Th1 cell responses. Immunity. 37 (4), 660-673 (2012).
  8. Le Gros, G., Ben-Sasson, S. Z., Seder, R., Finkelman, F. D., Paul, W. E. Generation of interleukin 4 (IL-4)-producing cells in vivo and in vitro: IL-2 and IL-4 are required for in vitro generation of IL-4-producing cells. J Exp Med. 172 (3), 921-929 (1990).
  9. Swain, S. L., Weinberg, A. D., English, M., Huston, G. IL-4 directs the development of Th2-like helper effectors. J Immunol. 145 (11), 3796-3806 (1990).
  10. Zhang, D. H., Cohn, L., Ray, P., Bottomly, K., Ray, A. Transcription factor GATA-3 is differentially expressed in murine Th1 and Th2 cells and controls Th2-specific expression of the interleukin-5 gene. J Biol Chem. 272 (34), 21597-21603 (1997).
  11. Zheng, W., Flavell, R. A. The transcription factor GATA-3 is necessary and sufficient for Th2 cytokine gene expression in CD4 T cells. Cell. 89 (4), 587-596 (1997).
  12. Dong, C. TH17 cells in development: an updated view of their molecular identity and genetic programming. Nat Rev Immunol. 8 (5), 337-348 (2008).
  13. Jiang, S., Dong, C. A complex issue on CD4(+) T-cell subsets. Immunol Rev. 252 (1), 5-11 (2013).
  14. Rudensky, A. Y. Regulatory T cells and Foxp3. Immunol Rev. 241 (1), 260-268 (2011).
  15. Sakaguchi, S., Yamaguchi, T., Nomura, T., Ono, M. Regulatory T cells and immune tolerance. Cell. 133 (5), 775-787 (2008).
  16. Barzaghi, F., Passerini, L., Bacchetta, R. Immune dysregulation, polyendocrinopathy, enteropathy, x-linked syndrome: a paradigm of immunodeficiency with autoimmunity. Front Immunol. 3, 211 (2012).
  17. Shea, J. J., Paul, W. E. Mechanisms underlying lineage commitment and plasticity of helper CD4 T cells. Science. 327 (5969), 1098-1102 (2010).
  18. Zhou, L., Chong, M. M., Littman, D. R. Plasticity of CD4+ T cell lineage differentiation. Immunity. 30 (5), 646-655 (2009).
  19. Harrington, L. E., et al. Interleukin 17-producing CD4+ effector T cells develop via a lineage distinct from the T helper type 1 and 2 lineages. Nat Immunol. 6 (11), 1123-1132 (2005).
  20. Langrish, C. L., et al. IL-23 drives a pathogenic T cell population that induces autoimmune inflammation. J Exp Med. 201 (2), 233-240 (2005).
  21. Park, H., et al. A distinct lineage of CD4 T cells regulates tissue inflammation by producing interleukin 17. Nat Immunol. 6 (11), 1133-1141 (2005).
  22. Ivanov, I. I., et al. The orphan nuclear receptor RORgammat directs the differentiation program of proinflammatory IL-17+ T helper cells. Cell. 126 (6), 1121-1133 (2006).
  23. Chung, Y., et al. Critical regulation of early Th17 cell differentiation by interleukin-1 signaling. Immunity. 30 (4), 576-587 (2009).
  24. Reynolds, J. M., Martinez, G. J., Chung, Y., Dong, C. Toll-like receptor 4 signaling in T cells promotes autoimmune inflammation. Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (32), 13064-13069 (2012).
  25. Reynolds, J. M., et al. Toll-like receptor 2 signaling in CD4(+) T lymphocytes promotes T helper 17 responses and regulates the pathogenesis of autoimmune disease. Immunity. 32 (5), 692-702 (2010).
  26. Wu, C., et al. Induction of pathogenic TH17 cells by inducible salt-sensing kinase SGK1. Nature. 496 (7446), 513-517 (2013).
  27. Ghoreschi, K., et al. Generation of pathogenic T(H)17 cells in the absence of TGF-beta signalling. Nature. 467 (7318), 967-971 (2010).
  28. Veldhoen, M., Hocking, R. J., Atkins, C. J., Locksley, R. M., Stockinger, B. TGFbeta in the context of an inflammatory cytokine milieu supports de novo differentiation of IL-17-producing T cells. Immunity. 24 (2), 179-189 (2006).
  29. Avni, O., et al. T(H) cell differentiation is accompanied by dynamic changes in histone acetylation of cytokine genes. Nat Immunol. 3 (7), 643-651 (2002).
  30. Matheu, M. P., Cahalan, M. D. Isolation of CD4+ T cells from mouse lymph nodes using Miltenyi MACS purification. J Vis Exp. (9), (2007).
  31. Bedoya, S. K., Wilson, T. D., Collins, E. L., Lau, K., Larkin, J. Isolation and th17 differentiation of naive CD4 T lymphocytes. J Vis Exp. (79), e50765 (2013).

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Cite This Article
Flaherty, S., Reynolds, J. M. Mouse Naïve CD4+ T Cell Isolation and In vitro Differentiation into T Cell Subsets. J. Vis. Exp. (98), e52739, doi:10.3791/52739 (2015).

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