Summary

Mouse Naïve CD4<sup> +</sup> Isolamento T cellulare e<em> In vitro</em> Differenziazione in T sottopopolazioni cellulari

Published: April 16, 2015
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Summary

Naïve CD4+ T cells polarize to various subsets depending on the environment at the time of activation. The differentiation of naïve CD4+ T cells to various effector subsets can be achieved in vitro through the addition of T cell receptor stimuli and specific cytokine signals.

Abstract

Antigen inexperienced (naïve) CD4+ T cells undergo expansion and differentiation to effector subsets at the time of T cell receptor (TCR) recognition of cognate antigen presented on MHC class II. The cytokine signals present in the environment at the time of TCR activation are a major factor in determining the effector fate of a naïve CD4+ T cell. Although the cytokine environment during naïve T cell activation may be complex and involve both redundant and opposing signals in vivo, the addition of various cytokine combinations during naive CD4+ T cell activation in vitro can readily promote the establishment of effector T helper lineages with hallmark cytokine and transcription factor expression. Such differentiation experiments are commonly used as a first step for the evaluation of targets believed to promote or inhibit the development of certain CD4+ T helper subsets. The addition of mediators, such as signaling agonists, antagonists, or other cytokines, during the differentiation process can also be used to study the influence of a particular target on T cell differentiation. Here, we describe a basic protocol for the isolation of naïve T cells from mouse and the subsequent steps necessary for polarizing naïve cells to various T helper effector lineages in vitro.

Introduction

Il concetto di linee o di sottoinsiemi di CD4 + T helper distinti (gi), le cellule è stato intorno dal momento che la seconda metà del 20 ° secolo 1. Riconoscimento dell'antigene cognate in presenza di segnali di costimolazione risultati in vari cicli di proliferazione cellulare e l'eventuale differenziazione in cellule effettrici Th. Il tipo di cellule Th generati durante questo processo dipende sull'ambiente citochina presente durante l'attivazione 2. Inizialmente, le cellule Th naive sono stati pensati per polarizzarsi in 2 linee distinte seguenti recettore delle cellule T (TCR) attivazione, costimolazione CD28 legatura, e la segnalazione di citochine. 1 le cellule helper tipo (Th1) sono caratterizzati dalla loro produzione effettore della citochina IFNγ nonché la loro esigenza di IL-12 di segnalazione durante il processo di differenziazione 3,4. Alla fine si è scoperto che le cellule Th1 differenziate hanno un profilo genetico che è più tipicamente caratterizzata by l'espressione del fattore di trascrizione famiglia scatola T, Tbx21 (T-bet), che è considerato il principale regolatore del programma genetico Th1 5. Inoltre, IL-12 e IFNγ può promuovere espressione T-bet 6,7. Nella risposta immunitaria, le cellule Th1 sono importanti per la difesa contro i patogeni intracellulari e forti promotori di infiammazione autoimmune. In contrasto, cellule helper di tipo 2 (Th2) richiedono IL-4 per il loro sviluppo e le citochine effettrici, tra IL-4, IL-5 e IL-13, sono importanti per guidare le risposte delle cellule B e sono patogeni allergia 8, 9. Simile a cellule Th1, le cellule Th2 sono stati trovati ad esprimere la propria principale regolatore trascrizionale, chiamato GATA-3 10,11. È interessante notare la presenza di citochine polarizzanti e la generazione di una specifica linea Th sono antagonisti allo sviluppo di altri 2,12, suggerendo che solo un particolare sottoinsieme Th può diventare dominante durante un re immunitariorisposta.

Poiché l'identificazione delle linee Th1 e Th2, ulteriore lavoro ha dimostrato ancora più unica sottogruppi di cellule T helper, incluse follicolare helper (TFH), IL-9-produzione (Th9), e IL-22-produzione (Th22) (recentemente rivisto in 13). Ai fini di esperimenti di differenziazione in vitro, questo protocollo si concentrerà solo su due sottoinsiemi gi altri, chiamati cellule T regolatorie (Treg) e-17-producono IL cellule CD4 + T (Th17). Cellule T regolatrici CD25 + possono verificarsi in natura (nTreg) nel timo; cellule Th naïve possono anche essere indotti (iTreg) per diventare normativa in periferia (rivisto in 14,15). Entrambi i tipi di Tregs esprimono un fattore di trascrizione caratteristico, definito scatola forkhead P3 (Foxp3), che è critica per i loro meccanismi di soppressione effettori che includono la produzione solubili anti-infiammatori mediatore, IL-2 consumo, e delle cellule meccanismi contatto-dipendente 14,15. La mancanza di Foxp3 risultati espressione di una grave, multiorgano malattia autoimmune chiamati disregolazione immunitaria, poliendocrinopatia, enteropatia, la sindrome X-linked (IPEX), dimostrando il ruolo critico di questo sottoinsieme Th nel risolvere l'infiammazione e regolazione tolleranza periferica di auto antigeni 16. In vitro, le cellule helper CD4 + T naive up-regolano Foxp3 e diventare impegnati nel programma Treg dopo stimolazione con IL-2 e TGF-β 14,15. Ci possono essere da moderata a notevole plasticità in linee cellulari T CD4 +, soprattutto se si considera solo la produzione di citochine (rivisto in 17,18). Tuttavia, ai fini di protocolli di differenziamento in vitro, discuteremo ogni sottoinsieme come un lignaggio unico.

Recentemente, un sottogruppo di cellule Th17 che produce la citochina IL-17 è stato identificato come un lignaggio unico con funzioni pro-infiammatorie che sono particolarmente patogeni durante l'infiammazione autoimmune 19-21. Cellule Th17 esprimono un fattore di trascrizione unico, chiamato retinoidi legati orfano recettore gamma t (RORγt) che coordina il programma genetico Th17 22. TGFβ è importante per la generazione di Th17 lineage attraverso l'induzione di RORγt. Tuttavia, l'effetto di segnalazione TGFβ è creduto per indurre unico impegno Th17 su synergizing con IL-6 (valutata in 12). Ulteriori studi hanno dimostrato che una varietà di altri segnali che possono regolare positivamente impegno Th17, comprese IL-1β, aumento del sodio, e TLR segnalazione 23-26. Altri studi hanno suggerito che i patogeni cellule Th17 in vivo sono quelli che ignorano di fatto la segnalazione TGFβ e invece si basano su una combinazione di IL-1, IL-6 e IL-23 per la loro differenziazione 27. Così, le cellule Th17 possono essere ricavati da una varietà di vie di segnalazione; ai fini del presente protocollo, comunemente usato il (TGFβ e IL-6), percorso per Th17 lineage impegnosarà presentato.

I protocolli di differenziazione descritti di seguito per tutti i lignaggi effettrici si basa su anticorpi fisso come stimoli per il TCR e CD28 durante l'intero corso dell'esperimento. Tuttavia, altri hanno dimostrato che l'attivazione TCR con l'antigene cellule presentanti l'28 o cross-linking anti-CD3 e anti-CD28 con anticorpi criceto per 2 giorni 29 sono anche mezzo altamente efficace per indurre la generazione di vari sottoinsiemi Th. Il protocollo presentato qui si basa su metodi precedentemente segnalati per isolare le cellule CD4 + T murine da organi linfoidi secondari 30 e la generazione di cellule Th17 31. Una differenza importante è che questo protocollo si basa sull'utilizzo di un cell sorter isolare le cellule CD4 + T naive dai tessuti linfoidi. Tuttavia, molte aziende offrono ora i kit di separazione rapidi che possono arricchire le cellule T CD4 + naïve, che può essere in grado di bypassare il requisito fo l'ordinamento seconda dell'esperimento. I metodi e reagenti presentati in questo protocollo sono ciò che abitualmente usiamo e troviamo per essere il più efficace. Tuttavia, tenere presente che esistono reagenti e metodi alternativi per molti dei passi presentati di seguito e spetta al laboratorio individuo per determinare che cosa funziona meglio per i loro scopi.

Protocol

Tutte le procedure sperimentali sono eseguite utilizzando protocolli approvati dall'ufficio di salute ambientale e sicurezza presso l'Rosalind Franklin University of Medicine and Science. C57BL / 6 topi (acquistato da NCI) utilizzato per questo protocollo è stato ospitato in condizioni esenti da organismi patogeni specifici, e tutti gli esperimenti sugli animali sono stati eseguiti utilizzando i protocolli approvati dalla cura e l'uso degli animali Comitato Istituzionale (IACUC) presso l'Rosalind Frankl…

Representative Results

Il punto di tempo per l'analisi di differenziazione può variare a seconda della condizione Th in prova e la forza di attivazione del recettore delle cellule T. Dopo 2-3 giorni di differenziamento, le cellule possono essere visualizzati al microscopio ottico per determinare l'entità della proliferazione delle cellule T. Wells espositrici vasta proliferazione e aggregazione delle cellule saranno molto probabilmente pronti per l'analisi al giorno 4. Condizioni di differenziazione si basa su l'aggiunta di …

Discussion

Mentre la milza contiene cellule Th naïve, la percentuale di questa popolazione in linfonodi è molto più alta. La mancata corretta identificazione e rimozione dei linfonodi in questo protocollo si tradurrà in una scarsa resa di cellule naïve. Questo può essere particolarmente difficile in topi di età superiore o topi maschi che hanno più tessuto grasso. Come mostrato in Figura 1, fissaggio e spinatura corretta degli arti animali e la pelle consentirà di facilitare la visualizzazione dei linfono…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Gli autori desiderano ringraziare tutti i membri del laboratorio di Reynolds a Rosalind Franklin University of Medicine and Science, e il laboratorio di Chen Dong presso l'Università del Texas MD Anderson Cancer Center per l'ottimizzazione di questo protocollo. Questo lavoro è stato sostenuto da una sovvenzione per JMR dal National Institutes of Health (K22AI104941).

Materials

Complete RPMI: Warm in a 37 oC water bath before use
RPMI 1640 Media Life Technologies 11875119
10 % FBS Life Technologies 26140-079
1000X 2-mercaptoethanol Life Technologies 21985023
100X Pen/Strep Life Technologies 15140122
100X L-glutamine Life Technologies 25030081
120 micron nylon mesh Amazon CMN-0120-10YD Cut into 2 cm2 squares and autoclave
Alternative: 100 micron cell strainers Fisher 08-771-19 Alternative to cutting nylon mesh
autoMACS running buffer Miltenyi 130-091-221 Warm in a 37 oC water bath before use
autoMACS rinsing solution Miltenyi 130-091-222 Warm in a 37 oC water bath before use
CD4 beads Miltenyi 130-049-201
ACK lysis buffer Life Technologies A10492-01
Cytokines:
Human (h) IL-2 Peprotech 200-02
Recombinant mouse (rm) IL-4 Peprotech 214-14
rmIL-6 R & D Systems 406-ML-025
rmIL-12 Peprotech 210-12
hTGFb R & D Systems 240-B-010
Antibodies:
2C11 (anti-CD3) BioXcell BE0001-1
37.51 (anti-CD28) BioXcell BE0015-1
11B11 (anti-IL-4) BioXcell BE0045
XMG1.2 (anti-IFNg) BioXcell BE0055
anti-CD62L-FITC BioLegend 104406 Use at 1:100
anti-CD25-PE BioLegend 102008 Use at 1:400
anti-CD4-PerCP BioLegend 100434 Use at 1:1000
anti-CD44-APC BioLegend 103012 Use at 1:500
Phorbol  12-myristate 13 acetate (PMA) Sigma-Aldrich P-8139 Prepare a stock at 0.1 mg/ml in DMSO and freeze aliquots at -20 oC
Ionomycin Sigma-Aldrich I-0634 Prepare a stock at 0.5 mg/ml in DMSO and freeze aliquots at -20 oC
Brefeldin A eBioscience 00-4506-51 Use at 1:1000

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Cite This Article
Flaherty, S., Reynolds, J. M. Mouse Naïve CD4+ T Cell Isolation and In vitro Differentiation into T Cell Subsets. J. Vis. Exp. (98), e52739, doi:10.3791/52739 (2015).

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