The zebra finch (Taeniopygiaguttata) is a valuable model organism; however, early stages of zebra finch development have not been extensively studied. The protocol describes how to dissect early embryos for developmental and molecular applications.
Der Zebrafink (Taeniopygia guttata) ist ein zunehmend wichtiger Modellorganismus in vielen Bereichen der Forschung einschließlich Toxikologie 1, 2, 3 Verhalten und Gedächtnis-und Lern 4,5,6. Als der einzige Singvogel mit einem sequenzierten Genoms hat die Zebrafinken ein großes Potenzial für den Einsatz in Entwicklungsstudien; jedoch die frühen Stadien der Zebrafinken Entwicklung nicht gut untersucht. Mangel an Forschung in Zebrafinken Entwicklung ist auf die Schwierigkeit der Zerlegung der kleinen Ei und Embryo zugeschrieben werden. Die folgende Präparation Verfahren minimiert embryonalen Gewebeschäden, die zur Untersuchung der Morphologie und Genexpression in allen Stadien der embryonalen Entwicklung ermöglicht. Dies ermöglicht sowohl Hellfeld-und Fluoreszenzbildqualität von Embryonen, verwenden Sie in der molekularen Verfahren wie die in-situ-Hybridisierung (ISH), Zellproliferationsassays und RNA-Extraktion zur quantitativen Assays wie quantitative real-time PCR (qtRT-PCR). Diese Technik ermöglicht Ermittler frühen Phasen der Entwicklung, die bisher nur schwer zugänglich waren zu studieren.
Das Ziel dieser Technik ist es, Zebrafinken (Taeniopygia guttata) Embryonen aus den frühesten Stadien der Embryogenese für den Einsatz in einer breiten Palette von Entwicklungsstudien zu erhalten. Zebra-Finken haben sich die vorherrschende Singvogel Modellorganismus und haben ausführlich in einer Vielzahl von Bereichen, einschließlich Toxikologie 1,2, 3 Verhalten, Gedächtnis und Lernen 4,5,6, vergleichende Neuroanatomie 7,8, 9,10 und Sprachentwicklung eingesetzt . Als der einzige Singvogel mit einem sequenzierten Genoms ermöglicht die Zebrafinken molekulare und genetische Untersuchung der Passeriformes Ordnung, die über 50% der bekannten Vogelarten, 11, 12,13 darstellt.
Trotz der Verwendung von erwachsenen und jugendlichen Zebrafinken in einer Vielfalt von Bereichen haben nur wenige Studien auf Zebrafink Embryonen insbesondere während der frühen Phasen der Entwicklung durchgeführt wurde. Dies ist auf die geringe Größe der Eier zurückzuführennd Embryonen und ihre neueren Status als Modellorganismus für 14,15,16 Studien, in denen das Huhn (Gallus gallus domesticus) wurde zuvor als vorherrschende Modellsystem verwendet, 17,18,19,20,21. Als nicht-stimmlichen Lernenden sind jedoch Hühner kein geeignetes Modellsystem für die Untersuchung der genetischen Grundlagen der Spracherwerb, die Entwicklung von Spracherwerb, Erblichkeit, das Verhalten und den kortikalen Basalganglien-Schaltung in 10 motorischen Lernen beteiligt.
Es ist wichtig zu beachten, dass Zebrafinken Embryonen sind viel empfindlicher und leicht beschädigt, als Hühnerembryonen bei der Präparation und molekulare Verfahren. Insbesondere ist größere Sorgfalt erforderlich, wenn die Durchführung Permeabilisierung Schritte auf Zebrafinken Embryonen. Starke Reinigungsmittel und Enzyme, die nicht schaden würde einen Hühnerembryo können Zebrafinken Embryonen schädigen. In Bezug auf die allgemeine Pflege, ist es notwendig, Zebrafinken Eier in kleinen Tassen vor der Platzierung in einem Brutschrank gestelltum sie zu brechen beim Rollen während der Inkubation zu verhindern.
Zebrafinken sind zugänglich für Verhaltensstudien, einfach und produktiv zu züchten jährig in Gefangenschaft, und Gesangslernende. Diese Eigenschaften ermöglichen die Verwendung von Zebrafinken, die Notwendigkeit für einen Modellorganismus, die Entwicklung, Genetik und Verhaltensaspekte der Sprache integriert ehen. Die Dissektionen Methoden unten beschrieben, verbunden mit einem neu entwickelten Inszenierung Führungs spezifischen Zebrafinken 22, machen den Zebrafinken ein immer nützlich, standardisierte Entwicklungsmodell Organismus. Allerdings erhalten Embryonen in frühen Stadien kann entmutigend sein. Dieses Protokoll ermöglicht die Ermittler leicht Embryonen im Frühstadium zu erhalten. Studien, die die frühe Entwicklung und der molekularen Entwicklungs Grundlage komplexer Verhaltensweisen in Zebrafinken oder die toxikologischen Wirkungen auf die Entwicklung in anderen klein, Sperlingsvögel finden diese Dissektion Methodik nützlich.
Neueste Entwicklung eines embryologischen Staging Führung 22 und Genom-Annotation machen die Zebrafinken eine wünschenswerte Modellorganismus für Entwicklungsstudien. Doch die geringe Größe und Zerbrechlichkeit der Zebrafinken Embryonen, die von 3 bis 7 mm in den Stufen 1 reichen – können 10 22, Dissektionen schwierig machen 11, 14. Lokalisieren und sauberen Entfernen Embryonen von der Oberfläche des Eigelbs kann schwierig sein. Dieses Protokoll bietet ausreichend detailliert, das Verfahren mit Leichtigkeit auszuführen. Dieses Protokoll zeigt die kritischen Schritte, die nicht in der Regel bekannt, aber notwendig sind, um eine erfolgreiche Präparation zu gewährleisten. Zum Beispiel ist es wichtig, eine kleine Schicht von Eigelb zwischen dem Embryo und Blatt Papier wiegen auszuschließen kleben lassen.
Sowohl die Identifizierung und Entfernung des Embryos kann schwierig sein. Zu beheben Identifizierung des Embryos auf der Oberfläche des Dotters, strahlen Licht direkt über dem Dotter nach hat eswurde aus dem Ei entfernt, und schauen Sie sich das Eigelb in einem 45 °-Winkel, um den Embryo zu finden. Sobald der Embryo befindet, schneiden Sie das Eigelb auf einem Papiergewicht kümmert, um den Embryo nicht zu reißen.
Wenn weitere Anwendungen sind für Abbildungs anatomischen Unterschiede, in situ Hybridisierung oder Zellproliferationsassays, ist es wichtig, die Dotterhaut in Stufe 1 zu entfernen – 8 22 zur besseren Veranschaulichung der Strukturen. Wenn Schwierigkeiten beim Entfernen der Eigelb oder die Dotterhaut in frühen Stadien, fix den Embryo in 4% PFA vor dem Waschen in 1X PBS zu embryonalen Anfälligkeit zu verringern. Durch die ersten Dotterhaut Entfernen bei der Präparation, wie beschrieben, sind die Strukturen deutlich sichtbar und unversehrt in Zebrafinken Embryonen nach der Durchführung einer in-situ-Hybridisierung.
Eine Einschränkung der EdU ist, dass die Verabreichung von Dosierungsmengen über 478 nl führt zu embryonalen Todesfall. Allerdings erlaubt die große Dosierungsbereich varying Ebenen der proliferativen Zell Tagging.
Die "Klick"-Reaktion in diesem Kit verwendet wird, ist die Kupfer (I)-katalysierte Azid-Alkin-Cycloaddition-(Cu (I)-AAC). In dieser spezifischen Reaktion wird ein Alkin-haltigen Thymidin-Analogon-Molekül (EDU) von aktiv teilenden Zellen eingebaut. Das Alkin-Gruppe in der EDU ragt aus der helikalen Struktur der DNA und wird durch Belichtung mit einem Azid-Molekül zu einem grünen, fluoreszierenden Molekül, das an dem freien Alkin-Gruppe bindet, konjugiert. Die grüne Fluoreszenz zeigt die neu proliferierende Zellen im Embryo. Die Bio-Orthogonalität der Azid-Alkin-Gruppen und die verhindert, dass nicht-spezifische Färbung, weil diese reaktiven Spezies sind nicht natürlich in Organismen vor. Auch, weil die DNA nicht benötigen, um die Reaktion stattfinden denaturiert werden, können weitere DNA-abhängige Analyse leicht durchgeführt 27.
Eine inhärente Einschränkung dieser Methode ist die geringe Größe und fragility von Zebrafinken Embryonen. Entfernen der Dotterhaut von Embryonen Stufen 1-15 22 in schädlichen embryonalen Strukturen führen, wenn nicht mit Vorsicht durchgeführt. Dieses Protokoll vereinfacht jedoch die Dissektion Verfahren, so dass die Ermittler zu frühen embryonalen Stadien nutzen, um strukturelle Anomalien und der Genexpression, die nicht vorher eingehend untersucht haben, zu untersuchen. Dieses Protokoll öffnet den Weg für eine Vielzahl von zellulären Assays, welche Molekular die Ermittler, um die Entwicklungs Ursprünge der Erwachsenen Phänotypen bestimmen werden. Zum Beispiel wird es möglich sein zu prüfen, Genexpression unter verschiedenen Umweltbedingungen in Verbindung gebracht oder Gesangslern folgenden pharmakologischen Behandlungen in den frühesten Entwicklungsstadien 28, 29,30,31. Obwohl in dieser Arbeit nicht gezeigt hat, erlaubt dieses Verfahren möglicherweise für andere Verfahren wie radioaktive in situ Hybridisierung auf Gewebeschnitten Zebrafinken und Elektroporation / in ovo Chirurgie 32, 33,34. Da der Zebrafink wurde als ein wichtiger Modellorganismus in einem riesigen Körper der Literatur etabliert, wie Studien ungenutzte Möglichkeiten zur Entwicklungsmechanismen mit erwachsenen Physiologie und Verhalten zu verknüpfen, insbesondere die Entwicklung der Sprache 7, 9.
The authors have nothing to disclose.
Die Autoren danken ihren Finanzierungsquellen, Howard Hughes Medical Institute Undergraduate Science Education-Programm, um das College of William and Mary; Zuschuss Sponsor: NIH (MSS); Förderkennzeichen: R15NS067566. Sie Unterstützung vom College of William and Mary, Fachbereich Biologie und der Hochschule für Künste und der Wissenschaften für die Unterstützung bei der Tierpflege auch anerkennen.
Chicken egg incubator | We use a Picture Window Hova-Bator Incubator, Circulated Air Model | ||
Click-iT EdU Alexa Fluor 488 Imaging kit | Invitrogen | C10337 | Detection of cell proliferation. |
Dissection microscope | We use Olympus SZ61 | ||
7'' Drummond capillary for Nanoject II injector | Drummond | 3-00-203-G/X | |
Drummond Nanoject II microinjector | Drummond | ||
Dumont Tweezers #55 | World Precision Instruments | 14099 | |
Ethanol (EtOH) | |||
50mL Falcon tube (polypropylene) | Fisher Scientific | 06-443-18 | |
FastPrep Lysis Matrix H tubes | MP biomedicals | 6917-100 | Used for RNA extraction, used to homogenize embryos |
Fiber optic illuminator lamps (High Intensity Illuminator) | Dolan-Jenner Industries | Fiber-Lite MI-150 | |
Glass vials with screw cap (DEPC treated) | Fisher Scientific | 03-338A | |
Microcentrifuge eppe tube (1.5 mL) | Fisher Scientific | 05-408-129 | |
Mineral oil | Sigma-Aldrich | M-8410 | |
Modeling Clay | Any brand | ||
Narshige PB-7 needle puller | Narshige | ||
Omni Bead Ruptor Homogenizer | OMNI International | 19-010 | Used for RNA extraction |
4% Paraformaldehyde (4% PFA): 20 mL 8% PFA (32g paraformaldehyde, 350mL sdd H2O, adjust pH to 7.6, 400mL sdd H2O), 20mL 2xPBS | Fixation of embryos. Caution, is harmful and do not inhale. | ||
Phosphate buffered saline (1xPBS): 200mL 10X PBS, 1800 mL Barnstead H2O, adjust pH to 7.4 | |||
Phosphate buffered saline (10xPBS): 800mL Barnstead, 2.013g KCL, 80.063g NaCl, 2.722g KH2PO4 monobasic, 14.196g Na2HPO4 dibasic, 200mL Barnstead H2O, adjust pH to 6.5 | |||
Phosphate buffered saline with 0.1% Tween-20 (1xPTw): 1800mL Barnstead H2O, 200mL 10X PBS, adjust pH to 7.4, 2mL Tween-20 | |||
35mL Plastic petri dish | Fisher Scientific | 08-757-100A | |
plastic wrap | Any brand | ||
Prepease RNA Spin Kit | PrepEase, Affymetrix | 78766 1 KT | Used for RNA extraction, used to homogenize embryos |
Reaction Mix: 875μL 1xPBS, 100mM 20μL CuSO4 (Kit Component E), 5μL Alexa Fluor 488 azide (Kit Component B), 100μL diluted reaction buffer additive (Kit Component F) | Invitrogen | C10337 | Detection of cell proliferation. |
sdd H2O | |||
Seed cup | We use it as a container when incubating eggs | ||
Stainless steel scalpel | |||
Standard nest box | We use Abba Plastic Finch Nestboxes | ||
4mL, Teflon Lined Cap, Glass Vials | Fisher Scientific | 02-912-352 | |
Transfer pipettes (polyethylene) | Fisher Scientific | 13-711-7M | |
4×4 weigh paper | Fisher Scientific | 09-898-12B |