נתיחה וניתוח במורד הזרם של הזברה פינק עוברים בשלבים מוקדמים של פיתוח

הצהרת אתיקה: השיטות נערכו עם פרושים זברה מבויתים ממושבת הרבייה במכללת ויליאם ומרי. כל הנהלים בעקבות הנחיות RSPCA 23 ואושרו על ידי מכללת ויליאם וOLAW של מרי (משרד המעבדה צער בעלי חיים) צער בעלי החיים Assurance (# A3713-01) והיו לו אישור הוועדה מוסדי טיפול בבעלי חיים ושימוש (IACUC) (# 2013-06 -02-8721-Dacris). 1. אוסף ביצה ודגירה להקים זוגות פינק זברה באור 14:10: מחזור כהה. אספקת מזון, מים, חציר, וכרצונך מודעת תיבת קן. הערה: טיפול שוטף ופורים לפרושי זברה תואר 23 כן. הכן את חממת חומוס רגילה עם מדפים מטה. הערה: שמור על החממה המלאכותית ב37.5 (+ / – 1) מעלות צלזיוס עם 80 – לחות 95% על ידי הוספת מים לחלק התחתון של החממה על בסיס יומי. לאפשר החממה ללאזן במשך יומייםלפני השימוש. בחר כוסות קטנות להאכיל (5 x 7.6 סנטימטר) לפחות 2.5 סנטימטר עמוקים להחזיק ביצים באינקובטור. קו התחתון וקצוות התחתונים של הכוס עם שתי שכבות של מגבת נייר, כך שהכוס מרופדת, תוך שהוא מאפשרים את הביצים לגלגל בקלות. הנח כוסות אלה על מדפי ההטיה של החממה. הערה: יותר מדי ריפוד יכול לעכב מתגלגל, אשר ימנע דגירה מוצלחת עקב הידבקות עוברית הפנים הפגז. לאסוף את הביצים בשתי שעות לאחר תחילת מחזור האור. הערה: זו מקטינה פערים בפיתוח קרקע לזמן דגירה ניתנה בשל דגירה של הורים. לאסוף את ביצים בעדינות עם אגודל ואצבע בקצה והבסיס לאורכו של הביצה. השתמש בעיפרון משעמם, רך 4B גרפיט לתייג את המועד שנקבע וזמן שנאסף מהקן. שים לב: עיפרון 4B הרך יותר מפחית את הסיכון לעיפרון לשבור את קליפת הביצה השבירה. 1.3.2) מניחים 1 – 5 ביצים שכותרת בכל אחד גבחממה, כך שביצים יכולות להתגלגל באופן חופשי כדי למנוע הידבקות עוברית הפנימי של הקליפה. הערה: הצבת יותר מ 5 ביצים בכוס עשויה למנוע גלגול של הביצים בודדות ולהפחית את הכדאיות של עוברים. 2. ההסרה של עובר מביצה כדי להתכונן לנתיחה, להרכיב את החומרים הבאים: אזמל נקי, מלקחיים קנס הטו, ושני מלקחיים בסדר הטה נוספים. הנח 10 x 10 סנטימטר שוקל נייר על בסיס ההיקף לנתח כדי לספק משטח נקי, שאינו סופג לנתיחה. הערה: הנייר לשקול הוא חיוני משום שהיא מאפשרת מניפולציה קלה של החלמון והוא המשטח הטוב ביותר לחיתוך הקרום העדין עם אזמל. הכן aliquot של חיץ מלוח פוספט (1X PBS) בצינור פוליפרופילן 50 מיליליטר, ולרכוש לפחות שלוש טפטפות העברה ודלי פסולת קטנה. אם לתקן את העוברים, להכין aliquot של paraformaldehyde 4% (PFA) זהירות:. אדי PFA הם רעילים,ד צריכים לעשות את כל הצעדים הכרוכים בPFA בתוך מנדף כדי לצמצם את החשיפה. אם הבזק הקפאת העוברים, להשיג חנקן נוזלי ולשמור אותו בסמוך להיקף לנתח. עקרות היא לא בעיה עבור פרוטוקול זה לנתיחה, אך להבטיח שכל החומרים הם נקיים. הסר את הביצה מן החממה בנקודת הזמן הדרושה לשלב הרצוי כמתואר במדריך להיערכות פינק זברה 22. הערה: הסר את הביצים לאחר 36 שעות של דגירה לנתח שלב 6 עוברים (איור 4 א) 22 ולהסיר את הביצים לאחר 56 שעות של דגירה לנתח שלב 12 עוברים (איור 3 א) 22. באמצעות מנורת הפנס סיבים אופטי, נר הביצה על ידי מחזיק אותו לאורך ציר האור ובוהק האנכי באמצעות הביצה כדי להאיר את הפנים. הנח את הקצה של האור מאחורי הביצה ולאתר את החלמון ואת העובר המתפתח. מקם את האזמל בצד השני את החלמון ולחתוך לאורך הביצה מקצה לבסיס עם לחץ קלוש. הסר את התוכן של הביצה על ידי הפעלת לחץ בזהירות על הקצה והבסיס של הביצה עם האגודל ואצבע המורה, או על ידי בעדינות החטטניות בנפרד את קליפת הביצה לאורך החתך עם מלקחיים. פתח את הביצה ישירות מעל הנייר לשקול כך שהחלמון מתגלגל החוצה בעדינות. לבחון את החלמון לאזור הלבן של צומת, המופיע כטבעת לבנה קלושה המקיפה את ההתפתחות עוברית ולכוון את החלמון באמצעות קנס נוסף הטה מלקחיים כך שהעובר נמצא במרכז. הערה: אם עיגול לבן קלוש על פני השטח של החלמון לא הוא ציין, לקחת את המלקחיים בסדר ובעדינות לגלגל את החלמון שוב עד שהעובר הוא בחלק העליון של החלמון. הערה: שלבים 1 – 9 22, הדיסק העוברי הוא פחות מ -6 מ"מ קוטר וגלוי כדיסק קלוש, מעט אטום על פני השטח של החלמון – ראה איור 1 עבור הפניה. לשלבים 10 ומעלה 22 בריכות דם, תאפשר שיפור visibility של העובר, אבל לטפל כדי למנוע ניקוב שק החלמון, שכן הדבר הופך את איתור העובר קשה. 3. ההפרדה העובר מרקמות חוץ עוברי לנקב את הקצוות של החלמון כדי להקל על לחץ (איור 1), ולבצע חתכים בודדים על פני האורך של קוטר החלמון לצד הדיסק העוברי. חזור על מה שהופך את הקווים האלכסוניים האלה עד הקטע של החלמון מכיל את העובר הופרד בהצלחה (איור 1). הערה: שלב זה מאפשר את מסת החלמון תישאר שלמה, אבל הלחץ המופחת על פני השטח של החלמון מאפשר יותר דיוק בעת חיתוך סביב העובר, מניעת נזק למבנים עובריים. הסר את הקצוות של החלמון עם טפטפת העברה. הערה: סר כמו חלמון ככל האפשר, אבל להשאיר כמות קטנה, כדי שהעובר לא ידבק למשטח היבש של הנייר והדמעה לשקול. שטוף את הדיסק העוברי על ידי dispensing 1X PBS בזווית של ° 45 לכיוון החלק התחתון של העובר. הנח את קצה פיפטה ההעברה לצד, לא מעל הדיסק העוברי. אם הצרכים של חלמון נוסף שיש להסירו, להפריד בין כל חלמון עם האזמל על נייר לשקול לפני העברת העובר לצלחת פטרי. הערה: שיטה זו מסירה את העובר מפני שטח של נייר לשקול. העבר את העובר באמצעות פיפטה העברה יחד עם נפח מינימאלי של 1X PBS לצלחת קטנה, פטרי מפלסטיק. שטוף את העובר על ידי הוספה יותר 1X PBS לתוך צלחת פטרי ונוטפות 1X PBS קרובה, אך לא ישירות על גבי, את העובר. לערבל את צלחת פטרי לשטוף ולהסיר את חלמון שייר, להטות את צלחת פטרי, ולהסיר פסולת 1X PBS עם טפטפת ההעברה. הערה: כאשר PBS 1X מוסר, העובר בדרך כלל אינו עומד בחלק התחתון של צלחת פטרי בגלל משטח הפלסטיק הוא חלקלק עם שיורי 1X PBS. עם זאת, ניתן להוסיף יותר 1X PBS אם העובר נדבק לצלחת. אם לא תיקוןהוא עובר, בצע את שלבי 3.5 ו3.6. אם הבזק הקפאת העובר, דלג לשלב 3.8 באופן מיידי. אם תיקן את העובר לכלאה באתר, להוסיף מייד PFA 4% לצלחת פטרי כדי להטביע את העובר. לטפטף PFA 4% ישירות על גבי החלק העליון של העובר על מנת לשטח אותו; זה מונע את העובר ממסתלסל. תקן את העובר בPFA 4% ב-C ° 4 לשעות 12. לאחר קיבוע, מייבש את העוברים במתנול מדורג פתרונות (MeOH) ולאחסן ב -20 מעלות צלזיוס ב100% MeOH. אם העובר הוא בין שלבי 1 – 8 22, להסיר את קרום vitelline דבק בעובר. הערה: ניתן לעשות זאת בשלב זה במהלך או לאחר הקיבוע. עוברים צעירים משלב 8 22 לא דמיינו בקלות משום שהם לדבוק בקרום vitelline, טשטוש מבנים מרכזיים כפי שניתן לראות באיור 2 א. גריפ הקצה של הקרום שמשתרע מעבר לאזור של צומת עם מלקחיים עדינים נוספים. Carefully להעיף את העובר על מספר רב של פעמים כדי לשטוף את גרגרי חלמון שייר וכדי לשחרר את ההיצמדות של הדיסק העוברי לקרום vitelline. הערה: אל תיגע במרכזו של העובר, שכן הדבר יפגע במבנים עובריים. אם פער אינו מופיע בין האזור לצומת וקרום vitelline, בעדינות לגרד את האזור של צומת עם קנס הנוסף הטה מלקחיים כדי לשחרר אותו מקרום vitelline. גריפ קרום vitelline עם קנס הנוסף הטה מלקחיים ומשוך בעדינות מן העובר. במידת צורך, משוך בעדינות את העובר מהקרום vitelline על ידי אחיזה בקצה ההיקפי של הדיסק העוברי באזור של צומת. מחק את קרום vitelline בפסולת ביולוגית מסוכן 1 (רמת בטיחות ביולוגית 1) לאחר ההסרה. בעת ביצוע assay ISH בשלבים עובריים צעירים, בצע את פרוטוקולי ההר ISH סטנדרטיים לגמרי עבור עובר חומוס 24, 25, אלא לשקול את ההצעות הבאות. <ol> כדי לצמצם את פגיעה בעוברים במהלך הליך ISH, השתמש בקבוקון זכוכית 5 מיליליטר יחיד עם כובע בורג לכל עובר. רק למלא בקבוקונים עם 2 – 3 מיליליטר של תמיסה, להבטיח כי העוברים הם שקועים באופן מלא. בקבוקוני Nutate אנכי על ידי הצבת 5 מיליליטר בקבוקונים למדף קלקר (או כל מתלה שתשאיר את הבקבוקונים מאובטחים) כי הוא מאובטח לnutator. הערה: אמצעי זהירות זה מונע את העובר מלהיות קרוע, אשר יכולה להתרחש כאשר הוא בא במגע עם את המכסה של הבקבוקון במהלך nutation האופקי. בשלב עוברים 6 – 0 22, לטפל עם 5 מיקרוגרם / מיליליטר proteinase K ב1X PTW במשך 5 דקות בטמפרטורת חדר. טיפול בעוברים מבוימים 7-12 22 עם 10 proteinase מיקרוגרם / מיליליטר K ב1X PTW 10 דקות ב 37 מעלות צלזיוס כדי להפחית מכתים רקע. כדי לייצר תגובת צבע מספיק כדי לזהות רמות נמוכות של ביטוי גנים בשלבי 1 – 10 22, דגירה עם ריכוז בדיקה 10 מיקרוגרם / מיליליטר לשעה 12. לשלבים בוגרים יותר, דגירה עם 1 & #956; גר '/ מיליליטר ריכוז בדיקה ב60 ° C. אם עובר הקפאת פלאש, להוסיף במהירות 2 – 3 מיליליטר 1X PBS לצלחת פטרי הבא לנתיחה ולהטות את צלחת פטרי כדי להפריד את העובר מגרגירי החלמון. הסר את הנוזל וחזור 2 – 3 פעמים כדי להסיר את כל החלמון. באמצעות קנס שקצהו מלקחיים, עובר העברה לצינור microcentrifuge מראש שכותרתו ופלאש הקפאה בחנקן נוזלי לפני האחסון ב -80 ° C. 4. הנייד edu למניעת הפצת הנשק Assay. התאגדות ואיתור של edu בעוברי פינץ' זברה. נר הביצה באמצעות מנורת הפנס סיבים האופטיים לאתר את העובר או חלמון. סמן את הצד של ההפך הביצה למיקום של העובר או חלמון בתוך הביצה כדי להבטיח שהעובר לא נפגע במהלך תהליך microinjection. קו צלחת פלסטיק 60 מ"מ עם פלסטלינה ולעצב אותו בצורה של קערה כדי להחזיק את הביצה בכיוון הרצוי. המקום המסומן צריך להיותאוריינטציה כדי לאפשר החדרת מחט microinjection באמצעות micromanipulator. הערה: החימר יתייצב הביצה במהלך microinjection וברחבי הדגירה בשלב 4.11. משוך שתי מחטי microinjection נימי זכוכית. להקהות מחט אחת לתקוע חור לתוך הביצה בנקודה המסומנת. הכן את מחט microinjection השנייה להזרקה על ידי backloading אותו עם שמן מינרלים והכנסתו לmicroinjector. הגדרת עוצמת הקול של פתרון שפורסם לכל זריקה ל59.8 NL על microinjector. טען את מחט microinjection עם פתרון המניות edu 10 מ"מ. ליצור חור במעטפת על המקום המסומן בנימי הזכוכית הקהות, נזהר שלא לשבור את הקליפה או ירידה חתיכות של הפגז לתוך חלל הביצה. לכוון את הביצה כך שהחור הוא בזווית של ° 45, המאפשר למחט microinjection להיות מוכנסת ישירות דרך החלל לחלמון או העובר. שימוש micromanipulator, הכנס אתנטען מחט כ 1.0 סנטימטר לתוך החלל. הזרק את הכמות הרצויה של פתרון edu ישירות על העובר או החלמון מתפתח. הערה: מקסימום של 478 NL של edu ניתן להזריק מבלי לגרום למוות עוברי. מייד עוטף את הביצה ואת בעל חימר עם מספר שכבות של ניילון נצמד כדי לכסות את הביצה ואת המנה, כדי למנוע התייבשות של העובר במהלך דגירה. קלטת הקצוות של העטיפה הפלסטיק לחלק התחתון של המנה, כדי למנוע מהפלסטיק unwrapping במהלך דגירה. הערה: הניילון נצמד צריך רק להסיר מייד לפני הניתוח. אפשר התאים מתרבים עתה לשלב edu על ידי דוגרים הביצה על 37 מעלות צלזיוס עד שיגיע לשלב הרצוי. לאחר הזרקה, לא יחזור ביצה להטיית מדפים בחממה. מניחים את הצלחת עטופה בפלסטיק חימר בשורה על משטח יציב בתוך האינקובטור. הסר את הניילון הנצמד ולנתח את העובר בעקבות הפרוטוקול האמור.תקן את העובר בPFA 4% ו דגירה שעות 12 על 4 מעלות צלזיוס כפי שתואר לעיל. לאחר קיבוע, לשטוף עם 100% אתנול (EtOH) למשך 5 דקות וחנות בEtOH 100% טריים ב -20 ° C עד לניתוח נוסף. 5. Edu "לחץ על" פרוטוקול תגובה כל הצעדים הבאים מבוצעים בבקבוקוני זכוכית. רעננותם עוברים עם שטיפות 5 דקות רצופות מהפעולות הבאות: EtOH, 75% EtOH ו25% deionized סטרילי מים מזוקקים (SDD), 50% EtOH ו50% מים SDD, 25% EtOH ו75% 1X PTW, 100% PTW 1X לשטוף שלוש פעמים ב100% PTW 1X 10 דקות כל אחד. לדלל את תוסף תגובת חיץ (קיט הרכיב F) על ידי שילוב של חלק 1 של פתרון 10X חיץ המניה (10 μl) עד 9 חלקים SDD מים (90 μl). מכין את תערובת התגובה בצינור נפרד על ידי הערבוב הבא: 875 μl 1X PBS, 20 μl CuSO 4, 5 אזיד μl, 100 μl תוסף חיץ תגובה בדילול מלא.הערה: נפח של תערובת התגובה וניתן לשנותם במורד. התגובה תעבוד אם העובר מכוסה לחלוטין בתערובת התגובה. מוסיף את התוסף בדילול חיץ תגובה (שלב 5.3) מייד לפני השימוש. כל הצעדים הבאים מבוצעים בחושך. כסה את העוברים עם נייר כסף כדי להגן מפני האור. מכסה את צלוחיות עם נייר אלומיניום, ודגירה אותם במאונך בטמפרטורת חדר במשך שעות על ידי הצבת אותם במעמד קלקר המצורף nutator. לשטוף את העוברים 3 פעמים בטריים 1X PBS 10 דקות כל אחד. דגירה את העוברים בPFA 4% טריים הלילה בשעה 4 ° C. לשטוף 3 פעמים ב 1X PBS 10 דקות כל אחד וחנות ברענן 1X PBS ב 4 ° C. כסה את העוברים בנייר עד לניתוח נוסף.