Измерение γHV68 инфекции у мышей
Summary
γ-Herpesviruses (γ-HVS) устанавливает пожизненное настойчивость в их хозяина. Заражение мышей с γ-HV68 обеспечивает генетически послушный<em> В естественных условиях</em> Модели для характеристики жизненного цикла / патогенезе γHVs. Этот протокол описывает обнаружения и количественного определения γHV68 инфекции при острых и латентных стадиях после заражения бляшкообразующих, инфекционный центр, и КПЦР анализов.
Abstract
γ-Herpesviruses (γ-HVS) отличаются способностью устанавливать скрытые инфекции лимфоидных клеток 1. Узком диапазоне множество человеческих γ-HVS, таких как ВЭБ и KSHV, серьезно препятствует детальные исследования патогенных. Мышей γ-герпесвирусов 68 (γHV68) акций обширные генетические и биологические сходства с человеческим γ-HVS и является естественным возбудителем мюрид грызунов 2. Таким образом, оценка γHV68 заражение мышей инбредных линий на разных стадиях вирусной инфекции служит важной моделью для понимания вирусной жизненного цикла и патогенез при γ-HVS инфекции.
После прививки интраназально, γHV68 инфекция приводит к острой виремии в легких, который позже решил в латентной инфекции спленоцитов и других клеток, что может быть возобновлен в течение всего срока хост 3,4. В этом протоколе мы опишем, как использовать доску анализа для оценкис инфекционным титром вируса в легких гомогенатах на Веро монослоев ячейки на ранней стадии (5 – 7 дней) после интраназального заражения (точек на дюйм). Хотя острой инфекции в значительной степени очистили 2 – 3 недели postinfection, латентной инфекции из γHV68 установлено около 14 точек на дюйм и поддерживаться в дальнейшем в селезенке мышей. Скрытая инфекция обычно поражает очень небольшой популяции клеток в инфицированных тканях, при этом вирус остается бездействующим и отключает большую часть своей экспрессии генов. Латентно-инфицированных спленоцитов спонтанно активировать вирус на культивирующий в искусственной среде в культуре ткани, которая может быть кратко изложил на инфекционный центр (ИЦ) анализа для определения вирусной нагрузки скрытой. Для дальнейшей оценки количества вирусных копий генома в острой и / или латентно инфицированных тканей, количественный ПЦР в реальном времени (КПЦР) используется для его максимальной чувствительности и точности. Комбинированный анализ результатов КПЦР и налета анализа и / или IC анализ покажет пространственно-временные профили вирусногорепликации и инфекционности в естественных условиях.
Protocol
Discussion
γHV68 был широко использован в качестве модели для понимания патогенеза человека γ-HVS 2,4,5. В этом протоколе, мы описали три обычно используются методы, в том числе доска тест для инфекционного титра вируса, IC анализ на вирусную нагрузку скрытой, и КПЦР вирусной нагрузки генома, для оц…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Авторы хотели бы признать, технические консультации и поддержку от Ren Солнца (Университет Калифорнии, Лос-Анджелес) и Seungmin Хван (Вашингтонский университет). Эта работа финансировалась Бакстер Фонд Национальных Институтов Здоровья грантов (R01 и R21 CA140964 AI083841 к C. Liang).
Materials
| Material Name | Preparation Procedure |
| Methylcellulose (MC) overlay medium for viral plaque assay |
|
| Fix/stain medium for plaque assay | 0.2% (w/v) crystal violet in 20% ethanol. |
| ACK Lysis Buffer | NH4Cl 0.15M, KHCO3 10mM, EDTA 0.1mM |
| Complete DMEM | Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM) supplemented with 10% fetal bovine serum (FBS; Invitrogen), 2 mM L-glutamine, and 1% penicillin-streptomycin (Gibco-BRL). |
Table 1. Specific media used in this protocol
| Name of the reagent | Company | Catalogue number |
| Ketamine | Sigma-Aldrich | K2753 |
| Xylazine | Sigma-Aldrich | X1251 |
| Methylcellulose | Sigma-Aldrich | M0512-250g |
| 2 x MEM | Life Technologies | 11935 |
| Cell strainer | BD Faclon | 352340 |
| Omni tissue homogenizer | OMNI International | TH115 |
| DNeasy Blood & Tissue Kit | Qiagen | 69504 |
| iQTM SYBRH Green Supermix | BioRad | 170-8882 |
| CFX96 real-time PCR system | Bio-Rad | 184-5072 |
| Cell counter | Bio-Rad | 145-0001 |
| Sorvall SA-600 | Thermo Scientific | 096-124022 |
Table 2. Specific reagents and equipment
References
- Damania, B., Choi, J. K., Jung, J. U. Signaling activities of gammaherpesvirus membrane proteins. J. Virol. 74, 1593-1601 (2000).
- Stevenson, P. G., Efstathiou, S. Immune mechanisms in murine gammaherpesvirus-68 infection. Viral. Immunol. 18, 445-456 (2005).
- Flano, E., Husain, S. M., Sample, J. T., Woodland, D. L., Blackman, M. A. Latent murine gamma-herpesvirus infection is established in activated B cells, dendritic cells, and macrophages. J. Immunol. 165, 1074-1081 (2000).
- Sunil-Chandra, N. P., Efstathiou, S., Nash, A. A. Murine gammaherpesvirus 68 establishes a latent infection in mouse B lymphocytes in vivo. J. Gen. Virol. 73, 3275-3279 (1992).
- Simas, J. P., Swann, D., Bowden, R., Efstathiou, S. Analysis of murine gammaherpesvirus-68 transcription during lytic and latent infection. J. Gen. Virol. 80, 75-82 (1999).
- Ganem, D. KSHV and the pathogenesis of Kaposi sarcoma: listening to human biology and medicine. J. Clin. Invest. 120, 939-949 (2010).
- Wen, K. W., Damania, B. Kaposi sarcoma-associated herpesvirus (KSHV): molecular biology and oncogenesis. Cancer. Lett. 289, 140-150 (2009).
- E, X. Viral Bcl-2-mediated evasion of autophagy aids chronic infection of gammaherpesvirus 68. PLoS. Pathog. 5, e1000609-e1000609 (2009).
- Marques, S., Efstathiou, S., Smith, K. G., Haury, M., Simas, J. P. Selective gene expression of latent murine gammaherpesvirus 68 in B lymphocytes. J. Virol. 77, 7308-7318 (2003).
- McCausland, M. M., Crotty, S. Quantitative PCR technique for detecting lymphocytic choriomeningitis virus in vivo. J. Virol. Methods. 147, 167-176 (2008).
- Weck, K. E., Kim, S. S., Virgin, H. I., Speck, S. H. B cells regulate murine gammaherpesvirus 68 latency. J. Virol. 73, 4651-4661 (1999).
- Weck, K. E., Kim, S. S., Virgin, H. I., Speck, S. H. Macrophages are the major reservoir of latent murine gammaherpesvirus 68 in peritoneal cells. J. Virol. 73, 3273-3283 (1999).
