Summary

מדידה של זיהום γHV68 ב עכברים

Published: November 22, 2011
doi:

Summary

γ-Herpesviruses (γ-HVs) להקים לאורך החיים התמדה ב המארח שלהם. זיהום של עכברים עם γ-HV68 מספק ממושמע גנטית<em> In vivo</em> מודל לאפיון של מחזור החיים / בפתוגנזה של γHVs. פרוטוקול זה מתאר את גילוי quantitation של זיהום γHV68 בשלבים חריפה בעקבות זיהום לטנטי על ידי המרכז, פלאק יוצרי זיהומיות, מבחני qPCR.

Abstract

γ-Herpesviruses (γ-HVs) בולטים על יכולתם להקים זיהומים סמויה של תאים הלימפה 1. טווח צר של האדם המארח γ-HVs, כגון EBV ו KSHV, יש הפריע קשות מחקרים פתוגניים מפורט. Murine γ-ההרפס 68 (γHV68) מניות דמיון גנטי וביולוגי נרחב עם אדם γ-HVs והוא הפתוגן טבעית של מכרסמים murid 2. לפיכך, ההערכה של זיהום γHV68 של עכברים זנים טהורים בשלבים שונים של זיהום ויראלי מספק מודל חשוב להבנת מחזור בפתוגנזה נגיפיים במהלך זיהום γ-HVs.

לאחר חיסון intranasal, γHV68 תוצאות זיהום viremia חריפה בריאה כי נפתרה מאוחר יותר לתוך זיהום לטנטי של splenocytes ותאים אחרים, אשר עשוי להיות מחדש לאורך חיי לארח את 3,4. בפרוטוקול זה, נתאר כיצד להשתמש assay פלאק על התחתכייל של וירוס מדבק בריאה homogenates על monolayers תא Vero בשלב מוקדם (5 – 7 ימים) של זיהום שלאחר intranasal (dpi). בזמן זיהום חריף מנוקה ברובו 2-3 postinfection שבועות, זיהום לטנטי של γHV68 מוקמת סביב 14 dpi ומתוחזק בהמשך בטחול של העכברים. זיהום לטנטי בדרך כלל משפיע על אוכלוסייה קטנה מאוד של תאים ברקמות נגועות, לפיו הנגיף נשאר רדום ומכבה ביותר של ביטוי גנים שלה. Splenocytes רדום נגועים בנגיף באופן ספונטני מחדש על explanting בתרבות רקמות, אשר יכול להיות סיכם על ידי assay זיהומיות (IC) המרכז כדי לקבוע את עומס ויראלי סמוי. כדי להמשיך להעריך את כמות העותקים של הגנום הנגיפי בחריפות ו / או רקמות נגועות רדום, כמותי בזמן אמת PCR (qPCR) משמש הרגישות המקסימלית שלה ואת הדיוק. מנתח בשילוב של תוצאות assay qPCR ורובד, ו / או assay IC יחשפו את הפרופילים spatiotemporal של נגיפישכפול infectivity in vivo.

Protocol

פרוטוקול הבא יתאר את המחקר של titers וירוס והמון הגנום הנגיפי במחזור זיהום ממס לבין הכמוס של γHV68 בעכברים, אשר יכולים תיאורטית לשמש כדי להעריך זיהום על ידי וירוסים אחרים שיתוף אורח חיים דומה לזה של γHV68. 1. הגברה של γHV68 <ol style=";text-align:right;…

Discussion

γHV68 כבר בשימוש נרחב כמודל להבין את הפתוגנזה של 2,4,5 אדם γ-HVs. בפרוטוקול זה, אנו תיאר שלוש שיטות בשימוש שגרתי, כולל assay פלאק עבור כייל הנגיף מדבק, assay IC עבור עומס ויראלי סמוי, ועל qPCR עבור עומס הגנום הנגיפי, כדי להעריך את זיהום חריף הכמוס של γHV68 לאחר חיסון intranasal בעכברים….

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

המחברים רוצים להכיר ייעוץ טכני ותמיכה רן Sun (אוניברסיטת קליפורניה, לוס אנג'לס) ו Seungmin הוואנג (אוניברסיטת וושינגטון). עבודה זו מומנה על ידי קרן בקסטר, המכונים הלאומיים לבריאות מענקים (R01 ו – R21 CA140964 AI083841 אל ג ליאנג).

Materials

Material Name Preparation Procedure
Methylcellulose (MC) overlay medium for viral plaque assay
  1. Heat ~ 250 ml of distilled water in TC bottle to > 80°C (boiling for 3 min in microwave)
  2. Add gradually 2.5 g MC powder into heated water, stirring over low heat until dissolved.
  3. Autoclave immediately for 15 min at liquid cycle.
  4. Stirring the autoclaved MC media at 4°C overnight.
  5. Combine 250 ml MC media with 200ml 2 x MEM (Gibco-BRL) + 50 ml FBS to give 500 ml overlay media.
Fix/stain medium for plaque assay 0.2% (w/v) crystal violet in 20% ethanol.
ACK Lysis Buffer NH4Cl 0.15M, KHCO3 10mM, EDTA 0.1mM
Complete DMEM Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM) supplemented with 10% fetal bovine serum (FBS; Invitrogen), 2 mM L-glutamine, and 1% penicillin-streptomycin (Gibco-BRL).

Table 1. Specific media used in this protocol

Name of the reagent Company Catalogue number
Ketamine Sigma-Aldrich K2753
Xylazine Sigma-Aldrich X1251
Methylcellulose Sigma-Aldrich M0512-250g
2 x MEM Life Technologies 11935
Cell strainer BD Faclon 352340
Omni tissue homogenizer OMNI International TH115
DNeasy Blood & Tissue Kit Qiagen 69504
iQTM SYBRH Green Supermix BioRad 170-8882
CFX96 real-time PCR system Bio-Rad 184-5072
Cell counter Bio-Rad 145-0001
Sorvall SA-600 Thermo Scientific 096-124022

Table 2. Specific reagents and equipment

References

  1. Damania, B., Choi, J. K., Jung, J. U. Signaling activities of gammaherpesvirus membrane proteins. J. Virol. 74, 1593-1601 (2000).
  2. Stevenson, P. G., Efstathiou, S. Immune mechanisms in murine gammaherpesvirus-68 infection. Viral. Immunol. 18, 445-456 (2005).
  3. Flano, E., Husain, S. M., Sample, J. T., Woodland, D. L., Blackman, M. A. Latent murine gamma-herpesvirus infection is established in activated B cells, dendritic cells, and macrophages. J. Immunol. 165, 1074-1081 (2000).
  4. Sunil-Chandra, N. P., Efstathiou, S., Nash, A. A. Murine gammaherpesvirus 68 establishes a latent infection in mouse B lymphocytes in vivo. J. Gen. Virol. 73, 3275-3279 (1992).
  5. Simas, J. P., Swann, D., Bowden, R., Efstathiou, S. Analysis of murine gammaherpesvirus-68 transcription during lytic and latent infection. J. Gen. Virol. 80, 75-82 (1999).
  6. Ganem, D. KSHV and the pathogenesis of Kaposi sarcoma: listening to human biology and medicine. J. Clin. Invest. 120, 939-949 (2010).
  7. Wen, K. W., Damania, B. Kaposi sarcoma-associated herpesvirus (KSHV): molecular biology and oncogenesis. Cancer. Lett. 289, 140-150 (2009).
  8. E, X. Viral Bcl-2-mediated evasion of autophagy aids chronic infection of gammaherpesvirus 68. PLoS. Pathog. 5, e1000609-e1000609 (2009).
  9. Marques, S., Efstathiou, S., Smith, K. G., Haury, M., Simas, J. P. Selective gene expression of latent murine gammaherpesvirus 68 in B lymphocytes. J. Virol. 77, 7308-7318 (2003).
  10. McCausland, M. M., Crotty, S. Quantitative PCR technique for detecting lymphocytic choriomeningitis virus in vivo. J. Virol. Methods. 147, 167-176 (2008).
  11. Weck, K. E., Kim, S. S., Virgin, H. I., Speck, S. H. B cells regulate murine gammaherpesvirus 68 latency. J. Virol. 73, 4651-4661 (1999).
  12. Weck, K. E., Kim, S. S., Virgin, H. I., Speck, S. H. Macrophages are the major reservoir of latent murine gammaherpesvirus 68 in peritoneal cells. J. Virol. 73, 3273-3283 (1999).

Play Video

Cite This Article
Pirooz, S. D., Lee, J., Zhao, Z., Ni, D., Oh, S., Liang, C. Measurement of γHV68 Infection in Mice. J. Vis. Exp. (57), e3472, doi:10.3791/3472 (2011).

View Video