Summary
γ-Herpesviruses (γ-HVS) estabelecer ao longo da vida a persistência em seus hospedeiros. Infecção de camundongos com γ-HV68 oferece uma geneticamente tractable<em> In vivo</em> Modelo para a caracterização do ciclo de vida / patogênese da γHVs. Este protocolo descreve a detecção e quantificação de γHV68 infecção em fase aguda e após a infecção latente por placas formadoras de centro, infecciosas, e ensaios de qPCR.
Abstract
γ-Herpesviruses (γ-HVS) são notáveis por sua capacidade de estabelecer infecções latentes de células linfóides 1. A gama de hospedeiros humanos estreito de γ-HVS, como EBV e KSHV, foi severamente prejudicado estudos detalhados patogênicos. Murino γ herpesvirus-68 (γHV68) ações extensa semelhanças genéticas e biológicas humanas com γ-HVS e é um patógeno natural de roedores murids 2. Portanto, a avaliação de γHV68 infecção de camundongos cepas puras em diferentes estágios da infecção viral fornece um modelo importante para a compreensão do ciclo de vida viral e patogênese durante γ-HVs infecção.
Após inoculação intranasal, γHV68 infecção resulta em viremia aguda no pulmão, que é posteriormente resolvido em uma infecção latente de esplenócitos e outras células, que pode ser reativada ao longo da vida do hospedeiro 3,4. Neste protocolo, vamos descrever como usar a placa de ensaio para avaliars título de vírus infeccioso no pulmão homogeneizados em monocamadas de células Vero na fase inicial (5-7 dias) do pós-infecção intranasal (dpi). Quando a infecção aguda é em grande parte limpa 2-3 postinfection semanas, uma infecção latente de γHV68 é estabelecida em torno de 14 dpi e mantido posteriormente no baço dos camundongos. Infecção latente geralmente afeta uma população muito pequena de células nos tecidos infectados, segundo o qual o vírus permanece latente e desliga a maioria de sua expressão gênica. Esplenócitos latentemente infectadas pelo vírus espontaneamente reativar sobre explanting em cultura de tecidos, que pode ser reproduzido por um centro de ensaio infecciosas (IC) para determinar a carga viral latente. Para melhor estimar a quantidade de cópias do genoma viral na forma aguda e / ou tecidos infectados de forma latente, quantitativa PCR em tempo real (qPCR) é usado para a sua sensibilidade máxima e precisão. As análises combinadas dos resultados da qPCR e placa de ensaio, e / ou ensaio IC irá revelar os perfis espaço-temporal de viralreplicação e infectividade in vivo.
Protocol
Discussion
γHV68 tem sido amplamente utilizado como modelo para compreender a patogênese da humana γ-HVs 2,4,5. Neste protocolo, descrevemos três métodos rotineiramente usados, incluindo ensaio de placa para o título de vírus infecciosos, teste de IC para carga viral latente, e qPCR para carga genoma viral, para avaliar a infecção aguda e latente de γHV68 após a inoculação intranasal em camundongos.
O ensaio de placa tem sido amplamente utilizado para determinar o título de ví…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Os autores gostariam de agradecer a assessoria técnica e apoio de Ren Sun (University of California, Los Angeles) e Hwang Seungmin (Washington University). Este trabalho foi financiado pela Fundação Baxter, National Institutes of Health subvenções (R01 e R21 CA140964 AI083841 para C. Liang).
Materials
| Material Name | Preparation Procedure |
| Methylcellulose (MC) overlay medium for viral plaque assay |
|
| Fix/stain medium for plaque assay | 0.2% (w/v) crystal violet in 20% ethanol. |
| ACK Lysis Buffer | NH4Cl 0.15M, KHCO3 10mM, EDTA 0.1mM |
| Complete DMEM | Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM) supplemented with 10% fetal bovine serum (FBS; Invitrogen), 2 mM L-glutamine, and 1% penicillin-streptomycin (Gibco-BRL). |
Table 1. Specific media used in this protocol
| Name of the reagent | Company | Catalogue number |
| Ketamine | Sigma-Aldrich | K2753 |
| Xylazine | Sigma-Aldrich | X1251 |
| Methylcellulose | Sigma-Aldrich | M0512-250g |
| 2 x MEM | Life Technologies | 11935 |
| Cell strainer | BD Faclon | 352340 |
| Omni tissue homogenizer | OMNI International | TH115 |
| DNeasy Blood & Tissue Kit | Qiagen | 69504 |
| iQTM SYBRH Green Supermix | BioRad | 170-8882 |
| CFX96 real-time PCR system | Bio-Rad | 184-5072 |
| Cell counter | Bio-Rad | 145-0001 |
| Sorvall SA-600 | Thermo Scientific | 096-124022 |
Table 2. Specific reagents and equipment
References
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