قياس γHV68 العدوى في الفئران
Summary
γ – Herpesviruses (γ – HVS) وضع الثبات مدى الحياة في البلدان المضيفة لهم. إصابة الفئران مع γ – HV68 يوفر لين العريكة وراثيا<em> في الجسم الحي</em> نموذج للتوصيف دورة / γHVs المرضية. يصف هذا بروتوكول الكشف والكميات من γHV68 العدوى الحادة في المراحل التالية ، وكامن العدوى عن طريق المركز ، لتشكيل لوحة المعدية ، والمقايسات qPCR.
Abstract
γ – Herpesviruses (γ – HVS) جديرة بالملاحظة لقدرتها على إقامة العدوى الكامنة من الخلايا اللمفاوية 1. وقد أعاق مجموعة ضيقة من المضيف الإنسان HVS – γ ، مثل EBV وKSHV ، شديدة الإمراض دراسات مفصلة. فأري γ – هربس 68 (γHV68) سهم واسعة الشبه الجينية والبيولوجية مع الانسان γ – HVS والممرض الطبيعية من القوارض مريد 2. مثل تقييم γHV68 العدوى الفطرية سلالات من الفئران في مراحل مختلفة من العدوى الفيروسية يقدم نموذجا هاما لفهم دورة الحياة الفيروسية والمرضية خلال γ – HVS العدوى.
عند التلقيح داخل الأنف ، ونتائج الإصابة γHV68 في viremia الحادة في الرئة التي يتم حلها في وقت لاحق الى عدوى الكامنة splenocytes والخلايا الأخرى ، والتي يمكن تنشيطها في جميع أنحاء الحياة من 3،4 المضيف. في هذا البروتوكول ، فإننا سوف تصف كيفية استخدام لوحة فحص لتقييمق عيار الفيروس المعدية في الرئة الخليط على monolayers فيرو الخلية في مرحلة مبكرة (5 — 7 أيام) من الأنف بعد الإصابة (نقطة في البوصة). بينما يتم مسح العدوى الحادة إلى حد كبير 2 — 3 أسابيع بعد العدوى ، عدوى الكامنة γHV68 يتم تأسيس حوالي 14 نقطة في البوصة وصيانتها لاحقا في الطحال من الفئران. العدوى الكامنة عادة ما يصيب السكان صغيرة جدا من الخلايا في الأنسجة المصابة ، بحيث يبقى الفيروس نائمة ويغلق معظم التعبير الجيني لها. splenocytes خفية المصابة تنشيط الفيروس تلقائيا عند explanting في زراعة الأنسجة ، والتي يمكن تلخيصها من قبل مقايسة المعدية (IC) مركز لتحديد الحمولة الفيروسية الكامنة. لمزيد من تقدير كمية من النسخ في الجينوم الفيروسي الحاد و / أو الأنسجة المصابة خفية ، PCR الكمي في الوقت الحقيقي (qPCR) يستخدم لحساسيتها ودقتها القصوى. فإن التحليلات المشتركة لنتائج الفحص qPCR والبلاك ، و / أو مقايسة IC تكشف ملامح من spatiotemporal الفيروسيةالتكرار والعدوى في الجسم الحي.
Protocol
Discussion
وقد استخدمت على نطاق واسع γHV68 نموذجا لفهم المرضية 2،4،5 γ – HVS الإنسان. في هذا البروتوكول ، وصفنا ثلاثة أساليب تستخدم بشكل روتيني ، بما في ذلك فحص لوحة عيار الفيروس المعدية ، IC مقايسة لتحميل الكامنة الفيروسية ، وqPCR لتحميل الجينوم الفيروسي ، لتقييم العدوى الحادة وا…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
فإن الكتاب أن نعترف المشورة الفنية والدعم من أحد رن (جامعة كاليفورنيا في لوس انجليس) وSeungmin هوانج (جامعة واشنطن). وقد تم تمويل هذا العمل من قبل مؤسسة باكستر والمعاهد الوطنية للصحة منح (R01 R21 CA140964 وAI083841 ليانغ جيم).
Materials
| Material Name | Preparation Procedure |
| Methylcellulose (MC) overlay medium for viral plaque assay |
|
| Fix/stain medium for plaque assay | 0.2% (w/v) crystal violet in 20% ethanol. |
| ACK Lysis Buffer | NH4Cl 0.15M, KHCO3 10mM, EDTA 0.1mM |
| Complete DMEM | Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM) supplemented with 10% fetal bovine serum (FBS; Invitrogen), 2 mM L-glutamine, and 1% penicillin-streptomycin (Gibco-BRL). |
Table 1. Specific media used in this protocol
| Name of the reagent | Company | Catalogue number |
| Ketamine | Sigma-Aldrich | K2753 |
| Xylazine | Sigma-Aldrich | X1251 |
| Methylcellulose | Sigma-Aldrich | M0512-250g |
| 2 x MEM | Life Technologies | 11935 |
| Cell strainer | BD Faclon | 352340 |
| Omni tissue homogenizer | OMNI International | TH115 |
| DNeasy Blood & Tissue Kit | Qiagen | 69504 |
| iQTM SYBRH Green Supermix | BioRad | 170-8882 |
| CFX96 real-time PCR system | Bio-Rad | 184-5072 |
| Cell counter | Bio-Rad | 145-0001 |
| Sorvall SA-600 | Thermo Scientific | 096-124022 |
Table 2. Specific reagents and equipment
References
- Damania, B., Choi, J. K., Jung, J. U. Signaling activities of gammaherpesvirus membrane proteins. J. Virol. 74, 1593-1601 (2000).
- Stevenson, P. G., Efstathiou, S. Immune mechanisms in murine gammaherpesvirus-68 infection. Viral. Immunol. 18, 445-456 (2005).
- Flano, E., Husain, S. M., Sample, J. T., Woodland, D. L., Blackman, M. A. Latent murine gamma-herpesvirus infection is established in activated B cells, dendritic cells, and macrophages. J. Immunol. 165, 1074-1081 (2000).
- Sunil-Chandra, N. P., Efstathiou, S., Nash, A. A. Murine gammaherpesvirus 68 establishes a latent infection in mouse B lymphocytes in vivo. J. Gen. Virol. 73, 3275-3279 (1992).
- Simas, J. P., Swann, D., Bowden, R., Efstathiou, S. Analysis of murine gammaherpesvirus-68 transcription during lytic and latent infection. J. Gen. Virol. 80, 75-82 (1999).
- Ganem, D. KSHV and the pathogenesis of Kaposi sarcoma: listening to human biology and medicine. J. Clin. Invest. 120, 939-949 (2010).
- Wen, K. W., Damania, B. Kaposi sarcoma-associated herpesvirus (KSHV): molecular biology and oncogenesis. Cancer. Lett. 289, 140-150 (2009).
- E, X. Viral Bcl-2-mediated evasion of autophagy aids chronic infection of gammaherpesvirus 68. PLoS. Pathog. 5, e1000609-e1000609 (2009).
- Marques, S., Efstathiou, S., Smith, K. G., Haury, M., Simas, J. P. Selective gene expression of latent murine gammaherpesvirus 68 in B lymphocytes. J. Virol. 77, 7308-7318 (2003).
- McCausland, M. M., Crotty, S. Quantitative PCR technique for detecting lymphocytic choriomeningitis virus in vivo. J. Virol. Methods. 147, 167-176 (2008).
- Weck, K. E., Kim, S. S., Virgin, H. I., Speck, S. H. B cells regulate murine gammaherpesvirus 68 latency. J. Virol. 73, 4651-4661 (1999).
- Weck, K. E., Kim, S. S., Virgin, H. I., Speck, S. H. Macrophages are the major reservoir of latent murine gammaherpesvirus 68 in peritoneal cells. J. Virol. 73, 3273-3283 (1999).
