1. Drosophila stammen GAL4 bestuurder: GMR-Gal4, die Gal4 uitdrukt in fotoreceptorcellen. UAS lijnen UAS-MJD78Q (of UAS-polyQ), die neurale degeneratie veroorzaakt in Gal4-expressie cellen. UAS-GFP, dat GFP uitdrukt in Gal4-expressie cellen. FLP lijnen ey-FLP, die FLP uitdrukt in fotoreceptoren en in subsets van hersengebieden. ET-FLPx2 lijnen, die zijn enhancer-trap regels met twee exemplaren van FLP (FLP-IRES-FLP). We hebben gegenereerd ~ 1000 ET-FLP lijnen (Bohm et al.., 2010), waarvan de expressie patronen moeten nog worden gekarakteriseerd. We beschrijven hier de karakterisering van het expressiepatroon van selecteren ET-FLPx2 in de larven en volwassen vlieg centrale zenuwstelsel (CZS). FLP verslaggever yw, actine P> CD2> Gal4, UAS-GFP (Pignoni & Zipursky, 1997), die rapporteert het expressiepatroon van ET-FLPx2 door actine P> Gal4, UAS-GFP op FLP-gemedieerde recombinationele excisie van> CD2. Twee elkaar aanvullende Gal80-converting tools Tub P> Gal80> (Gordon & Scott, 2009), de flip-out construct, die constitutief Gal80 uitdrukt in alle weefsels gedreven door een sterke tubuline promotor. Bij het FLP-gemedieerde recombinatie, is> Gal80 gedraaid uit en Gal80 uitdrukking wordt beëindigd slechts in ET-FLPx2 expressie weefsels. Tub P> stop> Gal80 (Bohm et al.., 2010), de flip-in construct, die niet Gal80 uiten onder normale omstandigheden. Gal80 uitdrukking is ingeschakeld door de tubuline promotor alleen in ET-FLPx2 expressie weefsels waarin FLP klapt> te stoppen en flips in Gal80. Vliegen voor het testen van Forever activiteit in de samengestelde oog GMR-Gal4, UAS-polyQ; bad P> stop> Gal80 (Bohm et al., 2010.), Die heeft degenereren en depigmented ogen. In FLP-expressie fotoreceptorcellen, is polyQ uitdrukking uitgeschakeld na Gal80 flip-in. GMR-Gal4, UAS-polyQ; (. Bohm et al., 2010) bad P> Gal80>, dat de normale ogen heeft. In FLP-expressie fotoreceptorcellen, is polyQ uitdrukking ingeschakeld na Gal80 flip-out. 2. Reagentia Fosfaat-gebufferde zoutoplossing (PBS, 1X), pH 7,4. 4% paraformaldehyde (PFA), verdund in PBS van 16% PFA, EM waardering (Cat # 15710, Electronic Microscopie Sciences, Hatfield, PA) PBT, 1XPBS met 0,1% Triton-X 100 (Sigma) Anti-Elav (mAb, 9F8A9; Developmental Studies Hybridoma Bank, de Universiteit van Iowa), vlekken alle neuronen in Drosophila. Anti-Repo (mAb 8D12; Developmental Studies Hybridoma Bank, de Universiteit van Iowa) vlekken gliale cellen in Drosophila. Alexa 594 kip tegen de muis secundair antilichaam (Invitrogen) 3. In kaart brengen van de expressie patroon van de enhancer-trap FLPx2 lijnen (* kritische stappen) Verzamel maagden vrouwtjes uit de yw, actine P> CD2> Gal4, UAS-GFP lijn en cross naar mannen van de individuele ET-FLPx2 lijnen. De voormalige dient als een GFP reporter voor weefsel expressie van ET-FLP. * Prepareer zwervende 3 e instar F1 larven, behouden de CNS (dat wil zeggen, de hersenen en het ventrale zenuw koord, VNC) en het lichaam muur, fix voor een uur in 4% PFA op ijs, was 3X met ijskoude PBS, gevolgd door 3x wassen met PBT. Ontleding Verwijder de zwervende 3 e instar F1 larven en plaats ze in een schone Sylgard schaal (35 mm x 10 mm petrischaal gevuld met 2 gram Sylgard – gemengd volgens de instructies productie). Verwijder voedselresten met penseel Vul de schaal met ijs-koude 1XPBS en plaats op ijs om de larven verdoven Houd de mond haken van een larve met een pincet en pak de cuticula de buurt van de uitbreiding van anterior luchtgat met een andere pincet en pel de cuticula naar de achterkant einde. Het centrale zenuwstelsel zal worden gehecht aan de mond te haken samen met de speekselklieren, darm, en imaginair schijven. Verwijder het overtollig weefsel en imaginaire schijven rondom het centraal zenuwstelsel. Overdracht van de CNS in een PBS-gevulde 3 goed pyrex schotel. Een gesiliconiseerde P200 pipetpunt kan gebruikt worden om te voorkomen dat het drogen van het weefsel. Fix voor 1 uur in 200 ul van 4% PFA op ijs. Zorg ervoor dat de CNS volledig wordt ondergedompeld in de PFA. Als de CNS drijvers, suggereert dit meestal dat het centrale zenuwstelsel niet goed gereinigd van het omringende weefsel. Was 3X met ijskoude PBS, gevolgd door 3x wassen met PBT. * Ontleden de CNS van volwassen F1 vliegen. Verdoven de vliegen met CO 2 of plaats de vliegen die in een leeg flesje op ijs gedurende 10 minuten. Plaats volwassen vliegen in een 95% EtOH gevulde glazen schaal op ijs gedurende 30 sec. Breng de volwassen vliegen in een 1XPBS gevulde glazen schaal op ijs. Was 3X met ijskoude 1X PBS om de resterende EtOH te verwijderen Plaats een vlieg in een 35mm Sylgard schaal gevuld met ijskoud 1X PBS Plaats de buikzijde naar boven en steek een klein insect pen (minutiens pins 0,1 mm) halverwege de buik. Met behulp van een tang houden de basis van de benen en verwijder de benen met een ander paar pincetten. Verwijder de kop cuticula Terwijl grijpen de proboscis met een pincet, een andere plaats onder het oog en schil de cuticula de richting van de dorsale middellijn van de vlieg hoofd. Pak het andere oog en verwijder de resterende cuticula aan de andere kant. Met behulp van scherpe pincet en / of aangescherpt wolfraam naald, verwijder tracheale weefsel rondom de hersenen Verkeerd reinigen van de trachea zal resulteren in een sterke auto-fluorescentie, belemmeren GFP expressie, en laat de hersenen te zweven tijdens de vaststelling VNC Dissection Verwijder de thoracale cuticula Vanaf het achterste einde van de thorax, plaats twee tangen aan elke zijde van de 3 e preepisternum (dat wil zeggen, grijpen de basis van de achterpoten). Voorzichtig los van de cuticula uit de buurt van de ventrale middellijn lijn, herhaal dit tot je bij de basis van de hals. Duw de twee helften van de borstkas cuticula het blootstellen van de VNC Volgende Verwijder de buik van de thorax. Hoewel het gebruik van een tang om de borstkas te houden bij de tweede poot basis, gebruik dan een andere pincet om de buik bij de 1e buik sternite grijp en trek de buik uit te schakelen. Om de VNC te verwijderen uit de omliggende thoracale weefsel. Houd de humerus gebied met een pincet en met een andere pincet zachte traan weg het grootste deel van de thoracale karkas. Op dit punt moet er een ring van bindweefsel rondom de cervicale bind (nek) zijn. Met behulp van twee tangen uit elkaar scheuren van de ring. Verwijder eventuele overtollige thoracale weefsel rondom de VNC Overdracht van de hersenen en VNC tot 9-goed pyrex schotel met 1X PBS op ijs Een gesiliconiseerde P200 pipetpunt kan gebruikt worden om te voorkomen dat het drogen van het weefsel * Fix de volwassen CNS gedurende 1 uur in 4% PFA op ijs en was 3X met ijskoude PBS en 3x met PBT. Incubeer de volwassen CZS voorbereiding of de larvale CZS en het lichaam muur bij 4 ° C gedurende de nacht met antilichamen om ofwel neuronen (anti-Elav, 01:10) of glia (anti-Repo. 1:10). Was de voorbereiding 5x met PBT. Incubeer met volwassen of larvale voorbereiding met Alexa 594 kip tegen de muis secundair antilichaam (1:100) bij kamertemperatuur gedurende 2 uur, en was de voorbereiding met PBS. Monteer de larven of volwassen CZS op een dia. Voor het behoud van de natuurlijke vorm van het centrale zenuwstelsel, gebruik dan een O-vormige plastic ring (Clear Versterking Label, Avery Dennison, Office Products, Brea, CA) op de dia als een mini-brug naar het dekglas te schorten. Onderzoek de voorbereiding voor GFP en Elav (of Repo) expressie patronen onder een fluorescentiemicroscoop. 4. De toepassing van twee complementaire Gal80-converting tools in repressie Gal4 in fotoreceptoren Flippen Gal80 plaats via bad P> Gal80> (figuur 5A). Verzamel mannetjes van de GMR-Gal4, UAS-polyQ; bad P> Gal80> lijn. Merk op dat de samengestelde ogen normaal zijn in deze vliegen. Mate met ey-FLP maagden. Verzamel de F1 vliegen en onderzoekt het oog fenotype. Flippen Gal80 in via bad P> stop> Gal80 (Figuur 5B). Verzamel GMR-Gal4, UAS-polyQ; bad P> stop> Gal80 mannelijk vliegen en onderzoekt het oog fenotype. Let op de gedegenereerde en gedepigmenteerde ogen in deze vliegen in vergelijking met wild-type stammen (Canton-S) Mate met ey-FLP maagden; Verzamel de F1 vliegen en onderzoekt het oog fenotype. Selecteer ET-FLPx2 lijnen met expressie in fotoreceptorcellen Stappen 4.1 en 4.2 kunnen worden herhaald met ET-FLPx2 lijnen die uitdrukken Forever in een subset van fotoreceptorcellen. Als alternatief, ofwel de GMR-Gal4, UAS-polyQ; bad P> stop> Gal80 vliegt of de GMR-Gal4, UAS-polyQ; bad P> Gal80> vliegen kunnen worden gekruist om individuele ET-FLPx2 lijnen voor het screenen op lijnen die te uiten FLP in fotoreceptorcellen. Waardevolle ET-FLPx2 lijnen zijn die enige uitdrukkelijke Forever in een subset of enkel fotoreceptorcellen (Figuur 6). 5. Representatieve resultaten De expressie patroon van een specifiek ET-FLPx2 lijn kan gemakkelijk worden onderzocht en gedocumenteerd in de F1 larven of volwassen vliegen afgeleid van de kruising tussen yw, actine P> CD2> Gal4, UAS-GFP maagden en ET-FLPx2 mannen (figuur 1) . Typisch, drie tot vijf herhalingen van de F1-dieren worden ontleed en onderzocht om de reproduceerbaarheid van de FLP expressiepatroon (Bohm et al.., 2010) te bepalen. <strong> Figuur 2 toont de expressie patroon van Forever in ET-FLPx2 lijn 173A in het larvale en volwassen CZS. De FLP patroon kan verder worden geanalyseerd met behulp van een neuronale gliale of marker (figuur 3 & 4). De resultaten weergegeven in Figuur 7 illustreert de effectiviteit van Gal80 flip-in en flip-out systemen in intersectionele repressie van Gal4 volgende FLP-gemedieerde recombinatie. De kuip P> stop> Gal80 bouwen lijkt niet aan een lekkende uitdrukking van Gal80 (op basis van de uniforme degeneratie en depigmentatie van de fotoreceptoren) hebben, en toch is het 100% effectief in flipping Gal80 in met de hulp van eyFLP te onderdrukken GMR- GAL4 en het herstel van het oog naar de normale optredens (fig. 7A). Integendeel, bad P> Gal80> volledig onderdrukt GMR-Gal4 vóór de invoering van de eyFLP. Volgende Gal80 flip-out,, GMR-Gal4 drives UAS-polyQ expressie leidt tot degenereren en depigmented ogen (Fig. 7B). In dit voorbeeld hebben we gebruik gemaakt van een pan-photorecetor Forever voor de fotoreceptor 'circuits' kaart, maar niet onderzoekt de gedragsmatige gevolgen. Met behulp van een soortgelijke aanpak met gedragsmatig relevante Gal4 lijnen, hebben we in kaart gebracht deel van de CCAP-Gal4 circuit reguleren vleugel expansie in volwassen vliegen (Bohm et al.., 2010). Wij zijn van mening dat de FINGR methode zal waardevol zijn in het helpen ons begrip van de neuronale basis van gedrag. Figuur 1. . Onderzoekt het expressiepatroon van een ET-FLPx2 line De FLP expressie patroon (blauwe ovalen) van een ET-FLPx2 lijn kan worden bepaald door kruising van een ET-FLPx2 man (linksboven) met een actine P> CD2> Gal4; UAS- GFP maagd (rechtsboven). Ubiquitous Actin P> Gal4 uitdrukking in het ouderlijk vrouw wordt gehinderd door het invoegen van de FRT (grijze driehoeken) geflankeerd CD2 volgorde. In de F1 nakomelingen, Forever zal accijnzen de CD2 serie, waardoor Actin P> Gal4 aan UAS-GFP expressie rijden. Figuur 2. Expressiepatroon van een ET-FLPx2 lijn in het larvale en volwassen centrale zenuwstelsel. Deze beelden tonen het CNS (hersenen en ventrale zenuw koord, VNC) ontleed van de nakomelingen van de kruising yw, actine-P> CD2> Gal4, UAS-GFP ouders om de ET-FLPx2 173A lijn. Door recombineren de> CD2> cassette, FLP activeert actine P> GAL4 expressie (de daaruit voortvloeiende uitdrukking van UAS-GFP). Vandaar dat de GFP patroon rapporten FLP-expressie brengende cellen. Paneel A toont de larvale FLP expressiepatroon terwijl paneel B geeft de volwassen expressiepatroon in de lijn 173A. Figuur 3. Karakterisering van celtypen die flippase uiten in ET-FLPx2 Line # 688A. A, A samengestelde afbeelding van een vaste F1 3 e instar larve gekleurd met anti-REPO uit een kruising tussen ET-FLPx2 regel # 688A en een GFP Flippase meldlijn. BD, Een hoge vergroting (Zeiss Plan-Apochromat 63x olie) opvatting van de achterste einde van een VNC uit een 3 e instar larven. Figuur 4. Karakterisering van celtypes in het lichaam van de paddestoel ET-FLPx2 Line # 150. AC, Een hoge-vergroting afbeelding (63x olie-immersie) van de paddestoel lichaam van een vaste F1 3e instar larve gekleurd met anti-repo. Figuur 5. Illustratie van Gal80 Flip-in en Flip-out Strategies. A. In de flip-out strategie, tubuline promotor-driven Gal80 (Tub P> Gal80>) is constitutief actief, wat resulteert in de onderdrukking van GMR-Gal4 en een wild-type eye fenotype (rode ogen). Deze repressie wordt verwijderd door de introductie van FLP (paars), die Gal80 out (midden, rood) flip en laat GMR-Gal4 naar UAS-polyQ uitdrukking rijden. Dit resulteert in fotoreceptorcel degeneratie (geïllustreerd door witte stippen in het oog). B. In het omgekeerde van de vorige strategie, is tubuline promoter-driven Gal80 uitdrukking onderbroken door FRT (grijze driehoek) geflankeerd "stop" stopcodon. Bij het ontbreken van Gal80, GMR-Gal4 bindt aan UAS-polyQ waardoor neuronale degeneratie in fotoreceptoren (geïllustreerd door witte stippen in het oog). Door het kruisen van de GMR-Gal4, UAS-polyQ; bad P> stop> GAL80 mannen met maagdelijke vrouwtjes die FLP te drukken in de fotoreceptorcellen, FLP (paars) zal recombinatie katalyseren op de FRT sites, weg te snijden van de "stop" codon (midden, rood), waardoor voor Gal80 expressie en onderdrukking van GMR-Gal4. Deze behoudt zich het neurodegeneratie in fotoreceptorcellen (geïllustreerd door het ontbreken van wHite stippen in het oog). Figuur 6. De toepassing van de methode in FINGR flipping Gal80 met behulp van ET-FLPx2 Line # 688A F1 nakomelingen van een kruising tussen ET-FLPx2 regel # 688A maagd voor GMR-Gal4, UAS-polyQ;. TubP> GAL80 man. Het ontbreken van pigment in het midden van het oog ommatidia vertegenwoordigt FLP uitdrukking in regel # 688A. In dit gebied Gal80 onderdrukking van de GMR-Gal4 was opgelucht waardoor de Gal4 om UAS-polyQ rijden. Figuur 7. De toepassing van de methode in FINGR omkeren Gal80 in of uit om Gal4 snijden in fotoreceptoren. A. De kuip P> stop> Gal80 flip-in systeem beperkt GAL4 uitdrukking in een Forever-afhankelijke manier. In GMR-Gal4, UAS-polyQ; bad P> stop> GAL80 vliegt, fotoreceptorcellen zijn gedegenereerd en pigmentloze (links vliegen). Na de introductie van eyFLP, is Gal80 uitgedrukt in fotoreceptorcellen, wat resulteert in volle repressie van de GMR-Gal4, die op zijn beurt schakelt de uitdrukking polyQ en produceert vliegt met normale ogen (rechts vliegen). B. De kuip P> Gal80> flip -out systeem werkt in de tegenovergestelde manier als de kuip P> stop> Gal80 flip-in systeem. Tub P> Gal80> constitutief onderdrukt GAL4 en onderdrukt de uitdrukking van polyQ (links vliegen, met normale ogen). Na de introductie van eyFLP, is Gal80 gedraaid uit fotoreceptorcellen, het verlichten van de onderdrukking van de GMR-Gal4 en het draaien op de expressie polyQ. Dit leidt tot vliegt met degenereren en depigmented ogen (rechts vliegen).