1. Drosophila 종자 Gal4 드라이버 : photoreceptor 세포의 Gal4을 표현 GMR – Gal4. UAS 라인 Gal4 – 표현 세포에서 신경 변성의 원인이 UAS – MJD78Q (또는 UAS – polyQ). Gal4 – 표현 세포에 GFP를 표현 UAS – GFP. FLP 라인 photoreceptors과 뇌 영역의 하위 집합에서 FLP을 표현 어이 – FLP. FLP의 두 사본 (FLP – IRES – FLP)를 포함하는 확장기 – 트랩 라인 아르 동부 표준시 – FLPx2 라인. 우리는 누구의 표현 패턴이 특징으로 아직 아르 ~ 1000 동부 표준시 – FLP 행 (봄 외., 2010), 생성했습니다. 여기, 우리는 애벌레와 어른 비행 중추 신경계 (CNS)에서 선택한 동부 표준시 – FLPx2의 표현 패턴의 특성을 설명합니다. FLP 기자 yw, 굴지 P> CD2> Gal4, UAS – GFP (Pignoni & Zipursky, 1997)를 통해 동부 표준시 – FLPx2의 표현 패턴을보고 굴지 P> Gal4;> CD2의 FLP – 중재 recombinational 절단시 UAS – GFP. 두 보완 Gal80 – 변환 도구 터브 P> Gal80> (고든 & 스콧 2009 년), constitutively 강력한 tubulin 프로 모터에 의해 구동 모든 조직에서 Gal80을 표현 플립 아웃 구축. FLP – 중재 재조합시> Gal80가 정신이 나갔죠하고 Gal80 표현은에 종료 동부 표준시 – FLPx2 – 표현 티슈합니다. 터브 P>> Gal80 (봄 외., 2010), 그만 정상적인 조건 하에서 Gal80을 표현하지 않는 구조, 기능 플립. Gal80 표현에만있는 tubulin 프로 모터에 의해 설정되어 동부 표준시 – FLPx2 – 표현 FLP가> 중지를 팅겨주는군요 및 Gal80에서 화나게하는 조직합니다. 화합물 눈을 FLP 활동을 테스트하기 위해 날아 GMR – Gal4, UAS – polyQ, 욕조 P>> 타락한 있습니다 Gal80 (봄 외, 2010). 그리고 depigmented 눈을를 중지합니다. 에서 FLP – 표현 photoreceptor 세포를 polyQ 표현은 Gal80 플립에 따라 해제되어 있습니다. GMR – Gal4, UAS – polyQ; (. 봄 외, 2010) 욕조 P> Gal80> 정상적인 눈을 있습니다. 에서 FLP – 표현 photoreceptor 세포를 polyQ 표현은 Gal80 플립 아웃 다음에 설정되어 있습니다. 2. 시약 인산 버퍼 호수 (PBS, 1X), 산도 7.4. PFA, EM 등급 (CAT # 15710, 전자 현미경 과학, 하트, PA) 16 %에서 PBS에 희석 4 % paraformaldehyde (PFA) 0.1 % 트리톤 X – 100 (시그마)를 포함 PBT, 1XPBS 안티 Elav (mAb, 9F8A9; 발달 연구 브리 도마 은행, 아이오와 대학교), 얼룩 Drosophila의 모든 뉴런. 안티 Repo (mAb 8D12; 발달 연구 브리 도마 은행, 아이오와 대학교)은 Drosophila의 얼룩 glial 세포를. 마우스 이차 항체에 대한 알렉사 594 치킨 (Invitrogen) 3. 향상제 – 트랩 FLPx2 라인의 표현 패턴을 (* 중요한 단계) 매핑 , yw에서 처녀의 여자를 수집 굴지 P> CD2> Gal4, UAS – GFP 라인 및 개별 동부 표준시 – FLPx2 라인의 남성을 교차. 전자 동부 표준시 – FLP의 조직 표현 GFP 기자로서의 역할을합니다. * 3 차 instar F1의 애벌레를 방황하고 해부하다, 얼음처럼 차가운 PBS로 3 배 세척, 얼음 4퍼센트 PFA 1 시간 동안 수정, CNS (즉, 뇌 및 복부 신경 코드, VNC) 및 신체 벽을 유지하여 다음 PBT와 배 씻는다. 해부 제 3 instar F1의 애벌레를 방황하고 제거하고 깨끗한 Sylgard 요리 (35mm Sylgard의 2g 가득 X 10mm 페트리 접시 – 혼합 지침에 따라 제조)로 그들을 놓으십시오. 페인트와 음식 부스러기를 제거 애벌레를 마취하기 전에 얼음을 얼음처럼 차가운 1XPBS과 장소로 접시를 채우기 포셉 한 쌍의있는 유충의 입 갈고리를 잡고 포셉 또 한 쌍의와 연장 앞쪽에 공기 구멍 근처 및 사후 끝 부분 표피 껍질 표피를 잡아. CNS는 침샘, 직감하고, imaginal 디스크와 함께 후크 입안에 첨부됩니다. 초과 조직과 CNS를 둘러싼 imaginal 디스크를 제거합니다. PBS – 채워진 3 잘 pyrex 접시에 CNS를 전송합니다. siliconized P200 피펫 팁은 조직을 건조하지 않도록하는 데 사용할 수 있습니다. 얼음 4퍼센트 PFA 200 μl 1 시간 동안 수정. CNS 완전히 PFA에 빠져들 있는지 확인하십시오. CNS가 수레 경우, 일반적으로 CNS가 제대로 주변 조직에서 청소 아니라는 것을 제안합니다. PBT와 배 세척 다음 얼음처럼 차가운 PBS로 3 배 씻으십시오. * 성인 F1의 파리의 CNS를 해부하다. CO 2와 함께 파리를 마취 또는 10 분 동안 얼음에 빈 유리병 안에 들어있는 파리를 놓으십시오. 플레이스 성인 30 초위한 얼음에 95 % EtOH – 가득한 유리 그릇에 난다. 얼음 유리 접시를 가득 1XPBS에 성인 파리를 전송합니다. 잔류 EtOH를 제거하는 차가운 1X PBS로 3 배 와시 35mm Sylga에 파리 플레이스차 요리는 얼음처럼 차가운 1X PBS로 가득 최대 직면하고있는 복부 측면을 놓고 복부를 통해 (minutiens 핀 0.1 mm) 미드웨이를 작은 곤충 펜을를 삽입합니다. 포셉 한 켤레를 사용하면 다리의 기반을 잡고 포셉 또 한 쌍의와 다리를 제거합니다. 머리 표피를 제거 포셉 한 쌍의와 코를 잡았지만, 눈 아래와 파리 머리의 등 부분의 중간 라인으로 표피 껍질 다른 장소. 다른 시선을 잡고 반대쪽에 남아있는 표피를 제거합니다. 날카로운 집게 및 / 또는 날카롭게 텅스텐 바늘을 사용하여 머리를 주변 tracheal 조직을 제거 기관의 부적 절한 청소 GFP 발현을 방해하고, 자동 형광 강한의 결과, 그리고 두뇌 고치는 동안 부동하실 수 있습니다 VNC의 해부 흉부 표피를 제거 제 3의 preepisternum 양쪽 두 개의 집게 (즉, 뒷다리의 기반을 잡아)은 장소, 흉부의 사후 끝에 시작. 부드럽게, 멀리 복부 정중선 라인에서 표피를 분리하면 목 기지에 도달할 때까지이 과정을 반복합니다. 부드럽게 VNC를 노출 흉부 표피의 두 반쪽을 확산 다음 흉부에서 복부를 제거합니다. 두 번째 다리 기지에서 흉부를 잡아 포셉 한 켤레를 사용하는 동안, 제 1 회 복부 sternite 근처의 복부를 움켜 포셉의 다른 쌍을 사용하여 복부를 당겨. 주변 흉부 조직에서 VNC를 제거하려면 다음과 같이하십시오. 포셉 한 쌍의과 멀리 포셉 부드러운 눈물 흉부 시체의 대부분의 다른 쌍의과 상박 골의 영역을 잡아. 이 시점에서 자궁 결합 (목) 주변 결합 조직의 고리가 있어야합니다. 이 집게를 사용하면 분리 반지를 눈물. VNC를 둘러싼 초과 가슴 조직을 제거 얼음 1X PBS를 포함하는 9 – 잘 Pyrex 요리에 두뇌와 VNC를 전송 siliconized P200 피펫 팁은 조직을 건조하지 않도록하는 데 사용할 수 있습니다 * 얼음 4% PFA 1 시간 동안 성인 CNS를 고정하고 PBT와 얼음처럼 차가운 PBS와 배로 배 세척. 4 성인 CNS 준비 또는 애벌레 CNS와 신체 벽을 품어 ° C 중 뉴런 (안티 – Elav, 1시 10분) 또는 glia (anti-Repo. 1시 10분)에 항체와 하룻밤. PBT와 5 배 준비를 씻으십시오. 2 시간을 위해 실내 온도에서 마우스 보조 항체 (1:100)에 대한 알렉사 594 닭고기와 성인이나 애벌레 준비 부화하고, PBS로 준비를 씻으십시오. 슬라이드에있는 애벌레 또는 성인 CNS를 탑재합니다. CNS의 자연 형태를 유지하려면, 커버 슬립을 중단하는 미니 다리로 슬라이드에 O – 모양의 플라스틱 반지를 (일반 강화 라벨, 에이버리 데니슨, Office 제품, 브레아, CA)을 사용합니다. 형광 현미경으로 GFP 및 Elav (또는 Repo) 표현을 패턴에 대한 준비를 검사합니다. 4. photoreceptors의 탄압 Gal4 두 개의 상호 보완적인 Gal80 – 변환 도구의 응용 욕조를 통해 P를 Gal80를 틀지> Gal80> (그림 5A). 욕조 P> Gal80> 라인, GMR – Gal4, UAS – polyQ에서 수컷를 수집합니다. 복합 눈이 파리에서 정상 있습니다. 어이 – FLP의 처녀와 친구. F1 파리를 수집하고 눈 표현형을 확인합니다. 를 통해 욕조에 Gal80도 틀지 P>> Gal80 (그림 5B)를 중지합니다. GMR – Gal4, UAS – polyQ를 수집, 욕조 P는>> Gal80 남성 파리를 중지하고 안과 표현형을 확인합니다. 타락한 참고 이러한 파리의 depigmented 눈이 야생 유형 종자 (캔턴 – S)에 비해 어이 – FLP의 처녀와 메이트; F1 파리를 수집하고 눈 표현형을 확인합니다. 선택 동부 표준시 – FLPx2 photoreceptor 세포의 표현과 함께 라인 단계 4.1 및 4.2는 동부 표준시 – FLPx2 라인을 사용하여 반복 수 photoreceptor 세포의 일부에서 표현 FLP 것을. 또는, 두 GMR – Gal4, UAS – polyQ, 욕조 P> 중지> Gal80 파리 또는 GMR – Gal4, UAS – polyQ, 욕조 P> Gal80> 파리는 선 스크린 개별 동부 표준시 – FLPx2 라인을 넘어 수 표현 photoreceptor 세포에서 FLP. 가치 동부 표준시 – FLPx2 라인은 그 것을 집합 또는 단일 photoreceptor 세포 (그림 6)에서만 익스프레스 FLP. 5. 대표 결과 특정 동부 표준시 – FLPx2 라인의 표현 패턴은 쉽게 검사하고 yw, 굴지 P 사이의 십자가에서 파생된 F1 유충이나 파리 성충에 설명되어 있습니다> CD2> Gal4, UAS – GFP의 처녀 및 ET – FLPx2 남성 (그림 1) . 일반적으로 3-5는 해부와 FLP 표현 패턴 (봄 외., 2010)의 재현성을 결정하기 위해 검사하는 F1 동물의 복제합니다. <st롱> 그림 2는 애벌레와 어른 CNS에서 동부 표준시 – FLPx2 라인 173A에서 FLP의 표현 패턴을 보여줍니다. FLP 패턴은 더욱의 연결 또는 glial 마커 (그림 3 및 4)을 사용하여 분석하실 수 있습니다. 그림 7에 표시된 결과는 Gal80 플립 기능의 효과를 설명하고 Gal4 다음 FLP – 중재 재조합의 교차 억압 시스템을 아웃 플립. 욕조 P> 중지> Gal80 구조는 Gal80의 새는 표현 (photoreceptors의 균일한 변성과 depigmentation 기준) 가지고 표시되지 않으며 아직은 주체할에 eyFLP의 도움으로 Gal80도 틀지 100 % 효과가 GMR을 Gal4 및 정상 모습 (그림의 7A)로 시선을 복원합니다. 반대로, 욕조 P는> Gal80가> 완전히 이전 eyFLP의 도입에 GMR – Gal4을 represses. GMR – Gal4 드라이브 UAS – polyQ 표현은 depigmented 눈 (그림의 7B) 타락한 및 선도, Gal80를 플립 아웃 다음. 이 예제에서, 우리는 photoreceptor '회로'를지도로 판 – photorecetor의 FLP를 사용하지만 행동 결과를 검사하지 않았다. behaviorally 관련 Gal4 라인과 유사한 방법을 사용하여, 우리는 파리 성충의 날개 확장 (봄 외., 2010) 규제 CCAP – Gal4 회로의 일부를 매핑. 우리는 FINGR 방법은 행동의 연결을 바탕으로 우리의 이해를 돕고에 도움이 될 것입니다. 그림 1. . 동부 표준시 – FLPx2 라인의 표현 패턴을 검토 동부 표준시 – FLPx2 라인에서 FLP 표현 패턴하기 (파란 타원) 동부 표준시 – FLPx2 남성 (상단 왼쪽) 굴지 P> CD2로> Gal4를 건너에 의해 결정 수 있으며, UAS – GFP 처녀 (오른쪽 위). 유비 쿼터스 굴지 P 부모의 여성에서> Gal4 표현은 FRT (회색 삼각형)의 어귀 CD2 시퀀스의 삽입에 의해 방해합니다. F1 자손에서 FLP는 엑사이스 CD2 순서를> Gal4는 UAS – GFP 발현을 드라이브에 굴지 P을 허용합니다. 그림 2. 애벌레와 어른이 중추 신경계에 동부 표준시 – FLPx2 라인 표현 패턴. 이러한 이미지는 짝짓기 yw, 굴지 P에서 생산되는 자식의 해부 CNS를 (뇌 및 복부 신경 코드, VNC) 묘사> CD2> Gal4, 동부 표준시 – 173A FLPx2 라인 UAS – GFP 부모. > CD2> 카세트를 recombining하여 FLP는 굴지 P> GAL4 표현 (UAS – GFP의 결과의 표현)가 활성화됩니다. 따라서 GFP 패턴 FLP – 표현 세포를보고합니다. 패널 B는 라인 173A의 성인 표현식 패턴을 보여주는 반면, 패널은 애벌레 FLP 표현 패턴을 보여줍니다. 그림 3. 동부 표준시 – FLPx2 라인 # 688A에 flippase을 표현 세포 유형의 특성화. A, 동부 표준시 – FLPx2 라인 # 688A와 GFP Flippase보고 라인 사이에 십자가에서 안티 REPO 물들일 고정 F1 제 3 instar의 유충의 합성 이미지. 3 차 instar의 유충에서 VNC의 뒷부분 끝에서 가져온 BD, 높은 배율 (자이스 혈구 계획 – 고차 색지움 63x 오일) 볼 수 있습니다. 그림 4. 동부 표준시 – FLPx2 라인의 버섯 신체 내의 세포 유형의 특성화 # 150. AC, 안티 REPO 물들일 고정 F1 세번째 instar의 유충에서 버섯 신체의 높은 배율 이미지 (63x 기름 침지). 그림 5. Gal80 플립 -와 플립 아웃 전략의 삽화. 플립 아웃 전략 A., tubulin 모터 구동 Gal80 (터브 P> Gal80>) GMR – Gal4의 억압과 야생 타입 눈 표현형 (레드 아이)의 결과, constitutively 활성화됩니다. 이 억압은 Gal80 아웃 (중, 빨간색) 플립 및 GMR – Gal4가 UAS – polyQ 표현을 운전하실 수 있습니다 FLP (보라색)의 도입에 의해 제거됩니다. photoreceptor 세포 변성이 결과를 (눈에 흰색 점의 그림). B. 이전 전략의 상호에서 tubulin 모터 구동 Gal80 표현은 "중지"코돈 어귀 FRT (회색 삼각형)으로 중단됩니다. Gal80의 부재에서 GMR – Gal4은 photoreceptors로의 연결을 퇴보를 (눈에 흰색 점의 그림)의 원인 UAS – polyQ에 바인딩합니다. GMR – Gal4, UAS – polyQ 횡단하여, 욕조 P>를 photoreceptor 세포에서 FLP을 표현 처녀 암컷, FLP (보라색)과> GAL80 남성은 "그만하세요"코돈 (중간을 절개, FRT 사이트에서 재조합을 catalyze 중단됩니다, 적색), 따라서 Gal80 표현과 GMR – Gal4의 억압에 대한 수 있도록합니다. 이것은 (W의 부족에 의해 그림 photoreceptor 세포의 neurodegeneration을 보유눈에 하이트 점). 그림 6. 동부 표준시 – FLPx2 라인에게 # 688A를 사용하여 밖으로 Gal80도 틀지에서 FINGR 방법의 응용 프로그램 동부 표준시 – FLPx2 라인 사이의 교차 GMR – Gal4, UAS – polyQ에 # 688A 처녀에서 F1 자손;. tubP> GAL80 남성. 눈 ommatidia의 한가운데에 색소의 부족 라인 # 688A에서 FLP 표현을 나타냅니다. 이 분야에서 GMR – Gal4의 Gal80 진압은 Gal4가 UAS – polyQ 운전 있도록 안심했습니다. 그림 7. photoreceptors에서 Gal4을 교차에 또는 밖 Gal80도 틀지에서 FINGR 방법의 응용 프로그램입니다. A. 욕조 P>> Gal80 플립의 시스템 FLP 종속적인 방식으로 GAL4 표현을 제한 중지합니다. 년 GMR – Gal4, UAS – polyQ, 욕조 P가> 중지> GAL80 파리, photoreceptor 세포가 퇴화하고 depigmented 아르 (왼쪽 날아). eyFLP의 도입에 따라, Gal80가 차례로 표현 polyQ를 끄고는 다음과 같이 정상적인 눈을 가진 파리 (오른쪽 플라이)를 생산 GMR – Gal4의 모든 억압의 결과로, photoreceptor 세포에 표현된다. B. 욕조 P> Gal80> 플립은 아웃 시스템이 욕조로 반대 방식으로 작동 P> 중지> Gal80 플립 – 인 시스템입니다. 터브 P는> Gal80은> constitutively GAL4을 represses하고 polyQ의 표현 (일반 눈으로, 파리 왼쪽) 표시되지 않습니다. eyFLP의 도입에 따라, Gal80는 GMR – Gal4의 억제을 덜어하고 표현 polyQ 켜기, photoreceptor 세포에서 밖으로 뒤집혀 있습니다. 이것은 퇴화하고 depigmented 눈 (오른쪽 플라이)와 파리가 발생합니다.