Карт и применение Enhancer-ловушки Выражение Flippase в личинок и взрослых Drosophila ЦНС
Summary
Мы описываем Flippase вызванных пересеченную Gal80/Gal4 репрессий (FINGR) метод, позволяющий тканеспецифические ФЛП, чтобы определить Gal80 моделей выражения. Везде, где Gal4 и ФЛП перекрываются, Gal4 выражение включена (Gal80 обалдела) или выключает (Gal80 перевернуто в). Метод FINGR является универсальным для клонального анализа и нейронных отображение контура.
Abstract
Gal4 / UES бинарный метод является мощным для генной манипуляции и нейронных схем у дрозофилы. Для большинства нейробиологических исследований, однако, Gal4 выражение редко тканеспецифические достаточно, чтобы обеспечить точное соотношение цепь с поведенческими показаний. Чтобы преодолеть это главное препятствие, недавно мы разработали FINGR методом достижения более ограничительный Gal4 выражение в ткани интересов. Метод FINGR состоит из трех компонентов: 1) традиционная система Gal4/UAS, 2) набор ФЛП / FRT-опосредованной Gal80 преобразования инструменты, и 3) усилитель-ловушки ФЛП (ET-ФЛП). Gal4 используется для определения первичной нервной системы интересов. Кожура Gal4 с UAS-эффектора, таких как UAS-MJD78Q или UAS-Ши тс, регулирует активность нейронов, которые, в свою очередь проявляются изменения в поведении летать. С дополнительной UAS-репортер, таких как UAS-GFP, нейронная цепь, участвующих в определенное поведение может быть одновременно отображается для морфологического анализа. Для Gal4 линий с широкой выражения, Gal4 выражения может быть ограничена с помощью двух дополнительных Gal80-превращающего инструменты: ванны P> Gal80> ('откидывающейся') и ванной P> остановка> Gal80 («флип в '). Наконец, следователи могут обратиться Gal80 или выключить, соответственно, с помощью тканеспецифические ET-ФЛП. В флип-в режиме Gal80 будет подавлять Gal4 выражение там, где Gal4 и ET-ФЛП пересекаются. В откидной режиме Gal80 избавит Gal4 репрессий в клетках, в которых Gal4 и ФЛП перекрываются. Оба подхода позволяют ограничение числа клеток в Gal4 определенные схемы, но в обратную картину. Метод FINGR совместим с обширной коллекцией Gal4 линий в лету сообщества и в высшей степени универсальным для традиционных клонального анализа и нейронных отображение контура. В этом протоколе, мы демонстрируем отображение модели ФЛП выражение в некоторых ET-FLPx2 линий и эффективности FINGR метод в фоторецепторных клеток. Принцип FINGR метод должен быть применим и к другим генетическим организмов модель, в которой Gal4/UAS, Gal80 и ФЛП / FRT используются.
Protocol
Discussion
Система Gal4/UAS широко и успешно используется Drosophilists для различных биологических исследований (Brand & Perrimon, 1993; Duffy, 2002). На сегодняшний день летают сообщество породило тысячи промоутер-приводом и усилителем-ловушки Gal4 линий. Одна из основных сильных метод FINGR является то, что он совместим с системой Gal4/UAS, что позволяет значительно расширить сила Gal4 у дрозофилы исследований.
Одним из важных применения метода FINGR является для тонкой настройки нейронных цепей, лежащие в основе поведения через Gal4/Gal80 пересечения. Такие действия могут включать, но не ограничиваясь этим, обучение и память, ухаживания, сон и суточный ритм. Метод FINGR также может быть использован для отображения критических нейронов, которые склонны к нейродегенерации в области моделирования человеческих нейродегенеративных заболеваний, таких как болезнь Альцгеймера, боковой амиотрофический склероз (ALS), и болезни Паркинсона. Кроме того, очаги нейронов или нейронных цепей решающее значение для посреднической кокаин, алкоголь, наркомания и другие вещества могут быть отображены использованием FINGR метод. Следует отметить, что условные Gal4s (Остервальдер и др., 2001;.. Римского и др., 2001) может быть использована с FINGR метод для того, чтобы получить временное управление нейронных цепей и поведения. Модификация Gal80-превращающего инструментов с помощью чувствительного к температуре Gal80 (Gal80 тс, McGuire и соавт., 2003) может привести к ванне P> остановка> Gal80 TS или ванной P> Gal80 ц>, дополнительно временной гибкости в цепь манипуляций. Кроме нервной системы, метод FINGR в равной степени применима к ограничению Gal4 выражение в подмножества клеток будь то крыло или ногу.
ET-FLPx2 линии будут ценным ресурсом для всех биологов дрозофилы заинтересованы в FRT / FLP основе клонального анализа (Xu & Рубин, 1993), в том числе MARCM (Lee & Ло, 1999). Кроме того, ожидается, что некоторые ET-FLPx2 линии могут заменить heatshock-ФЛП для производства воспроизводимых клонов и для повторных морфологических и поведенческих исследований. Как усилитель-ловушки Gal4 линий, наиболее ET-FLPx2 линии вряд ли могут быть выражены в частности, в клетках своих интересов. Большинство линий будет выражать ФЛП в клетках интерес и в других клеток или тканей, а также. Тем не менее, отсутствие "тканевой специфичности» как Gal4 и ET-FLPx2 не будет серьезной проблемой для FINGR метод, пока их области перекрытия желательно для конкретного эксперимента. FINGR призвана превратить два "широким" систем в изысканной один.
Методами показано на этих протоколов, а стандартные и должны быть воспроизводимыми. Основные предостерегающие шаги, которые требуют внимания своей являются отбор и использование фиксатора. Фиксаторы, кроме PFA следует избегать, потому что они утолят GFP сигнала. Мы также отметили, что рассечение блюдо не должно использоваться для фиксации с PFA, чтобы избежать возможности того, что ФЛП выражение не будет надежно сообщает GFP.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Мы благодарим фонд от внутренних университета Оклахомы (на З.) и гранта NSF (IOS-1025556, для BZ и RAB) для поддержки TRF, RAB, XP, ААО, MLW, CAS, и это исследование. NIH грант (RO1 NS060878, чтобы BZ) частично поддержана RAB. RAB признает NIH НРСА (T32 NS07292) обучение грант в университете Брандейса, и NIH грант (RO1 GM21473) присуждена Джеффри зале Брандейс, за поддержку на ранних стадиях исследования. Мы благодарим Джеффри зал для его непрерывного поощрений для этого проекта. Мы благодарим доктора Кристин Скотт за предоставление нам ванне P> Gal80> процедить.
References
- Bohm, R. A., Welch, W. P., Goodnight, L. K., Cox, L. W., Henry, L. G., Gunter, T. C., Bao, H., Zhang, B. A genetic mosaic approach for neural circuit mapping in Drosophila. Proc Natl Acad Sci U S A. 107, 16378-16383 (2010).
- Brand, A. H., Perrimon, N. Targeted gene expression as a means of altering cell fates and generating dominant phenotypes. Development. 118, 401-415 (1993).
- Bruno, B., Holbro, N., Reichert, H. Polycomb group genes are required for neural stem cell survival in postembryonic neurogenesis of Drosophila. Development. 134, 1091-1099 (2007).
- Duffy, J. B. GAL4 system in Drosophila: a fly geneticist’s Swiss army knife. Genesis. , 34-341 (2002).
- Gordon, M. D., Scott, K. Motor control in a Drosophila taste circuit. Neuron. 61, 373-384 (2009).
- Lee, T., Luo, L. Mosaic analysis with a repressible cell marker for studies of gene function in neuronal morphogenesis. Neuron. 22, 451-461 (1999).
- McGuire, S. E., Le, P. T., Osborn, A. J., Matsumoto, K., Davis, R. L. Spatiotemporal rescue of memory dysfunction in Drosophila. Science. 302, 1765-1768 (2003).
- Osterwalder, T., Yoon, K. S., White, B. H., Keshishian, H. A conditional tissue specific transgene expression system using inducible GAL4. Proc Natl Acad Sci USA. 98, 12596-12601 (2001).
- Pignoni, F., Zipursky, S. L. Induction of Drosophila eye development by decapentaplegic. Development. 124, 271-278 (1997).
- Roman, G., Endo, K., Zong, L., Davis, R. L. P[Switch], a system for spatial and temporal control of gene expression in Drosophila melanogaster. Proc Natl Acad Sci U S A. 98, 12602-12607 (2001).
- Xu, T., Rubin, G. M. Analysis of genetic mosaics in developing and adult Drosophila tissues. Development. 117, 1223-1237 (1993).
