我々は、Gal80発現パターンを決定するために組織特異的なFLPを可能にする、フリッパーゼ誘発性横切るGal80/Gal4弾圧(FINGR)メソッドを説明します。どこGal4のとFLPのオーバーラップは、Gal4の発現がオンになっています(Gal80アウト反転)またはオフ(Gal80がに反転)。 FINGRメソッドは、クローンの解析と神経回路のマッピングのための汎用性があります。
Gal4の/ UASバイナリ法では、 ショウジョウバエの遺伝子と神経回路の操作のための強力です。ほとんどの神経生物学研究のために、しかし、Gal4の発現はほとんど行動リードアウトと回路の正確な相関関係を可能にするために十分な組織特異的ではありません。この大きなハードルを克服するために、我々は最近、関心の組織でより制限Gal4の発現を達成するためにFINGR方法を開発した。 FLP / FRTを介するGal80変換するツールの2)のセット;伝統的なGal4/UASシステム1)と3)エンハンサートラップFLP(ET – FLP):FINGRメソッドは、3つのコンポーネントがあります。 Gal4のは、関心の主要な神経回路を定義するために使用されます。このようなUAS – MJD78QまたはUAS市TSとして、UAS -エフェクターとGal4のペアリング、順番にハエの行動の変化によって明示される神経活動を調節する。このようなUAS – GFPなどの追加UAS -レポーターで、特定の動作に関わる神経回路を同時に形態素解析のためにマッピングすることができます。浴槽P> Gal80>('外フリップ')と浴槽P>停止> Gal80('に反転"):広範な発現とGal4の行については、Gal4の発現は、二つの相補Gal80 -変換ツールを使うことで制限できます。最後に、捜査官が組織特異的ET – FLPの助けを借りて、それぞれ、Gal80をオンまたはオフにすることができます。 Gal4のとET – FLPが交差する場所にフリップのモードでは、Gal80はGal4の発現を抑制します。フリップアウトモードでは、Gal80はGal4のとFLP重複している細胞でGal4の抑圧を軽減します。どちらのアプローチは、GAL4 -定義された回路内のセル数の制限を有効にし、その逆パターンで。 FINGRメソッドは、Gal4のハエのコミュニティ内の行と伝統的なクローン分析のためにと神経回路のマッピングのための、汎用性の高い膨大なコレクションと互換性があります。このプロトコルでは、我々は選択ET – FLPx2線と視細胞におけるFINGR法の有効性のFLP発現パターンのマッピングを示しています。 FINGR法の原理はまた、Gal80 Gal4/UAS内の他の遺伝的モデル生物にも適用できるものです、とFLP / FRTが使用されます。
Gal4/UASシステムが広くされ、正常様々な生物学的研究のためのDrosophilists(;ダフィー、2002ブランド&Perrimon、1993)で使用されています。日付に、ハエのコミュニティは、プロモーター主導とエンハンサートラップGal4の何千行が生成されています。 FINGR法の大きな強みは、それが可能と大幅にショウジョウバエの研究でGAL4の力を拡大すること、Gal4/UASのシステムと互換性があることです。
FINGRの方法の一つの重要なアプリケーションは、Gal4/Gal80交差点通過行動の根底にある微調整する神経回路にすることです。これらの動作が含まれる可能性がありますが、学習と記憶、求愛、睡眠、および概日リズムが、これらに限定されない。 FINGRメソッドはまた、アルツハイマー病などのヒトの神経変性疾患、筋萎縮性側索硬化症(ALS)、およびパーキンソン病のモデリングにおける神経変性を受けやすい重要なニューロンをマップするために使用することができます。同様に、コカイン、アルコール、および他の物質の中毒を仲介するための重要な神経細胞や神経回路の病巣は、FINGRメソッドを使用してマッピングされる可能性があります。神経回路と行動の時間的な制御を得るためにFINGRメソッドで使用することができる、それは条件付きGal4sが(。。ローマンら、2001オスターヴァルダーら、2001)ことに留意すべきである。温度に敏感なGal80(Gal80 TS、マクガイアら、2003)を使用して、Gal80、変換ツールの変更は、生成することができます浴槽P>停止> Gal80 TSまたは浴槽P> Gal80 TS>、回路の操作で、さらに時間的な柔軟性を追加する。神経系を越えて、FINGRメソッドは、翼や足であるかどうか細胞のサブセットでGal4の発現を制限することも同様に適用できる。
ET – FLPx2線はMARCM(リー&羅、1999)を含むFRT / FLPベースのクローン解析(徐&ルービン、1993)、に興味があるすべてのショウジョウバエの生物学者にとって貴重なリソースとなります。また、一部のET – FLPx2ラインが再現可能なクローンを生成するため、繰り返し形態学的および行動解析のためのヒートショック- FLPを交換することが期待される。エンハンサートラップGal4の行と同じように、ほとんどのET – FLPx2ラインは自分の興味のある細胞で特異的に発現されることはほとんどありません。ほとんどの行は、目的の細胞と同様に他の細胞や組織のFLPを発現するであろう。しかし、Gal4のとET – FLPx2両方の"組織特異性"の欠如は、長い間彼らの重複領域が特定の実験のための望ましいとしてFINGR方式のための主要な関心事にはなりません。 FINGRは、洗練された一つに二つの"広範な"システムを変えるように設計されています。
これらのプロトコルで示された方法は、かなり標準的であると再現可能でなければなりません。自分の注意を要する主な注意事項の手順では、固定液の選択と使用法です。彼らはGFPのシグナルを消光するため、PFA以外の固定液は避けてください。我々はまた、解剖皿がFLPの発現が確実にGFPによって報告されなくなる可能性を避けるために、PFAで固定のために使用すべきではないことに注意した。
The authors have nothing to disclose.
我々は、オクラホマ大学(BZまで)とTRF、RAB、XP、AAO、MLW、CAS、およびこの研究をサポートするためのNSF(IOS – 1025556、BZとRABまで)からの助成金からの内部資金に感謝。 NIHの助成金(RO1 NS060878、BZに)部分的にサポートされているRAB。 RABは、本研究の初期段階を支援するためのブランダイス大学に授与NIH NRSA(T32 NS07292)訓練助成金、およびブランダイスでジェフリーホールに授与NIHの助成金を(RO1 GM21473)、認めている。我々はこのプロジェクトのための彼の継続的な激励のためにジェフリーホールに感謝。我々は、浴槽P> Gal80>株と私たちを提供するための博士クリスティンスコットに感謝。