نحن تصف Flippase بفعل القمع المتعدد الجوانب Gal80/Gal4 (FINGR) الأسلوب ، مما يسمح للأنسجة محددة FLP لتحديد أنماط التعبير Gal80. أينما Gal4 والتداخل FLP ، يتم تشغيل Gal4 التعبير على (Gal80 انقلبت الخروج) أو إيقاف (Gal80 المعكوسة في) الأسلوب FINGR هي متعددة للتحليل نسيلي ورسم خرائط الدوائر العصبية.
الأسلوب الثنائي Gal4 / UAS قوية للتلاعب الجيني والدوائر العصبية في ذبابة الفاكهة. لمعظم الدراسات العصبية الحيوية ، ومع ذلك ، نادرا ما يكون التعبير Gal4 الأنسجة محددة بما فيه الكفاية للسماح للارتباط دقيق الحلبة مع قراءات السلوكية. للتغلب على هذه العقبة الرئيسية ، ونحن وضعت مؤخرا طريقة لتحقيق FINGR أكثر تقييدا Gal4 التعبير في الأنسجة من الاهتمام. الأسلوب FINGR من ثلاثة عناصر : 1) نظام Gal4/UAS التقليدية ؛ 2) مجموعة من الأدوات Gal80 FLP / FRT بوساطة تحويل ؛ و 3) محسن شرك FLP (ET – FLP). يستخدم Gal4 لتحديد الدوائر العصبية الأساسية من الاهتمام. التقشير وGal4 مع UAS – المستجيب ، مثل UAS – TS UAS MJD78Q أو شي ، وينظم نشاط الخلايا العصبية ، التي هي بدورها تتجلى في إحداث تغييرات في السلوك الطيران. يمكن أن تكون إضافية مع UAS – المراسل مثل UAS – GFP ، الدائرة العصبية التي ينطوي عليها سلوك معين في وقت واحد محدد للتحليل الصرفي. لGal4 خطوط عريضة مع التعبير ، ويمكن أن يقتصر Gal4 التعبير باستخدام متكاملتين Gal80 – تحويل الأدوات : حوض P> Gal80> ('الوجه خارج') وحوض P> وقف> Gal80 ('في الوجه"). أخيرا ، يمكن للمحققين بدوره Gal80 أو خارجها ، على التوالي ، مع مساعدة من الأنسجة الخاصة ET – FLP. في الوجه في الوضع ، سوف Gal80 Gal4 قمع التعبير أينما وGal4 ET – FLP تتقاطع. في وضع الوجه إلى الخارج ، وسوف Gal80 Gal4 تخفيف القمع في الخلايا التي Gal4 FLP والتداخل. كلا النهجين تمكين تقييد عدد الخلايا في الدوائر Gal4 محددة ، ولكن في نمط العكسية. الأسلوب FINGR متوافق مع مجموعة واسعة من Gal4 خطوط الطيران في المجتمع وتنوعا للغاية لتحليل نسيلي التقليدية وخرائط الدوائر العصبية. في هذا البروتوكول ، ونحن لشرح رسم خرائط لأنماط التعبير في FLP ET FLPx2 تحديد خطوط وفعالية من الأسلوب FINGR في خلايا مستقبلة للضوء. وينبغي أن مبدأ الأسلوب FINGR أن تنطبق أيضا على غيرها من الكائنات نموذج الجينية التي تستخدم Gal4/UAS ، Gal80 وFLP / FRT.
وقد تم على نطاق واسع في النظام Gal4/UAS ويستخدم بنجاح من قبل Drosophilists للدراسات البيولوجية المختلفة (العلامة التجارية وPerrimon ، 1993 ؛ دافي ، 2002). حتى الآن ، وقد ولدت المجتمع يطير آلاف يحركها المروج ومحسن شرك خطوط Gal4. ومن نقاط القوة الرئيسية للأسلوب FINGR هو أنه متوافق مع نظام Gal4/UAS ، مما يجعل من الممكن توسيع نطاق كبير في قوة Gal4 في الدراسات ذبابة الفاكهة.
المهم تطبيق واحد من الأسلوب هو FINGR الدوائر العصبية الكامنة تهذيب السلوك من خلال Gal4/Gal80 التقاطع. قد تتضمن هذه السلوكيات ، ولكن لا تقتصر على والتعلم والذاكرة ، والتودد ، والنوم ، وإيقاع الساعة البيولوجية. ويمكن أيضا الأسلوب FINGR أن تستخدم لرسم خريطة للخلايا العصبية الحرجة التي تكون عرضة لأمراض التنكس العصبي في نمذجة الإنسان الاعصاب مثل الزهايمر والتصلب الوحشي الضموري (ALS) ، وأمراض الشلل الرعاش. وبالمثل ، قد يتم تعيينها من بؤر الخلايا العصبية أو الدوائر العصبية حاسمة للكوكايين وساطة ، والكحول ، وغيرها من إدمان المخدرات باستخدام أسلوب FINGR. وتجدر الإشارة إلى أن Gal4s الشرطي (Osterwalder وآخرون ، 2001 ؛ الرومانية وآخرون ، 2001..) ويمكن استخدامها مع طريقة FINGR من أجل السيطرة الزمنية الدوائر العصبية والسلوكيات. ويمكن تعديل أدوات – Gal80 تحويل باستخدام Gal80 حساسة للحرارة (Gal80 TS ، ماغواير وآخرون ، 2003) إنتاج الحوض P> وقف> Gal80 نهاية الخبر أو ف الحوض> Gal80 TS> ، مضيفا المزيد من المرونة الزمانية التلاعب في الدائرة. أبعد من الجهاز العصبي ، وطريقة FINGR ينطبق بالتساوي على تقييد Gal4 التعبير في مجموعات فرعية من الخلايا ما إذا كان هو الجناح أو الساق.
وسوف خطوط ET – FLPx2 يكون مصدرا قيما لجميع الأحياء ذبابة الفاكهة مهتمة FRT / FLP التحليل القائم على نسيلي (شو وروبن ، 1993) ، بما في ذلك MARCM (لي ولوه ، 1999). ومن المتوقع أيضا أن بعض خطوط ET – FLPx2 قد يحل محل heatshock – FLP للاستنساخ وتكرار لتكرار التحليلات المورفولوجية والسلوكية. مثل خطوط Gal4 محسن شرك ، فإن معظم ET – FLPx2 خطوط من غير المحتمل أن يتم التعبير عن وتحديدا في الخلايا من مصلحة احد. وأعرب معظم خطوط FLP في خلايا الفائدة وغيرها من الخلايا في الأنسجة أو كذلك. ومع ذلك ، فإن عدم وجود "خصوصية نسيج" على حد سواء وGal4 ET FLPx2 لا يشكل مصدر قلق كبير للأسلوب FINGR طالما منطقتهم متداخلة أمر مرغوب فيه لإجراء تجربة معينة. وقد صمم لتحويل FINGR البلدين واسع "في نظم واحد المكرر.
الأساليب هو موضح في هذه البروتوكولات هي المعيار وليس كما ينبغي استنساخه. الخطوات الرئيسية التي تتطلب الاهتمام تحذيرية واحد يتم اختيار واستخدام ومثبت. وينبغي تجنب مثبتات أخرى من منهاج العمل لأنها سوف يشفي GFP الإشارة. لاحظنا أيضا أنه لا ينبغي أن تستخدم طبق تشريح للتثبيت مع PFA لتجنب احتمال أن لا يكون التعبير FLP تفيد تقارير موثوق بها عن طريق GFP.
The authors have nothing to disclose.
نشكر صندوق داخلي من جامعة أوكلاهوما (لBZ) ، ومنح من المؤسسة القومية للعلوم (IOS – 1025556 ، لBZ و RAB) لدعم TRF ، الرب ، XP ، AAO ، MLW ، المستخلصات ، وهذه البحوث. منحة المعاهد الوطنية للصحة (RO1 NS060878 ، لBZ) دعما جزئيا RAB. RAB يعترف بوجود NRSA المعاهد الوطنية للصحة (T32 NS07292) منحة تدريبية لمنح جامعة برانديز ، ومنحة المعاهد الوطنية للصحة (RO1 GM21473) منحت لقاعة جيفري في برانديز ، لدعم المراحل الأولى من هذه الدراسة. نشكر جيفري قاعة تشجيعات لسموه المتواصل لهذا المشروع. نشكر الدكتور كريستين سكوت لتزويدنا الحوض ف سلالة>> Gal80.