Summary

Marcatura specifica di HIV-1 Cellule positive con un Rev-dipendente Vector lentivirali Esprimendo la proteina fluorescente verde

Published: September 23, 2010
doi:

Summary

Abbiamo sviluppato un vettore lentivirale che possiede, oltre alla Tat-reattiva LTR, l'Ap-risposta elemento (RRE) che possono regolare l'espressione genica giornalista in modo da HIV-1 Tat e Rev-dipendente. Il vettore consente l'individuazione specifica di replicare l'HIV nelle cellule viventi attraverso l'espressione di GFP.

Abstract

La maggior parte di HIV-reattiva vettori di espressione sono basati sul promotore di HIV, la ripetizione terminale lunga (LTR). Mentre risponde ad una proteina HIV in fase precoce, Tat, la LTR è anche sensibile agli stati di attivazione cellulare e per l'attività di cromatina locale dove l'integrazione è avvenuta. Questo può portare ad alta HIV-indipendente attività, e ha limitato l'utilità di LTR-reporter per marcare le cellule HIV positivi 1,2,3. Qui, abbiamo costruito un vettore di espressione lentivirali che possiede, oltre alla Tat-reattiva LTR, numerose sequenze di DNA dell'HIV che includono l'Ap-risposta elemento e dei siti di splicing HIV 4,5,6. Il vettore è stato incorporato in un virus giornalista lentivirale, consentendo il rilevamento altamente specifici di replicare l'HIV in popolazioni di cellule viventi. L'attività del vettore è stata misurata l'espressione della proteina fluorescente verde (GFP). L'applicazione di questo vettore come riportato qui offre un nuovo approccio alternativa ai metodi esistenti, come la PCR in situ o colorazione dell'antigene HIV, di identificare le cellule HIV-positive. Il vettore può anche esprimere geni terapeutici per la sperimentazione clinica o di base per indirizzare le cellule HIV-positive.

Protocol

1. Trasfezione di plasmidi per la produzione delle particelle lentivirali Rev-dipendente Set up: The Rev-dipendente GFP vettori lentivirali, PNL-GFP-RRE-SA, è stato descritto in precedenza 4,5,6. Per assemblare in una particella virale, il plasmide è stato contransfected in cellule HEK293 T con HIV-1 costruire imballaggi, pCMVΔ8.2 (gentilmente fornito dal Dr. Didier Trono), e un plasmide porta la glicoproteina VSV-G (pHCMV-G) . La trasfezione è stata effettuata utilizzando il metodo di fosfato di calcio. Preparazione di tamponi: 10 X HBS (Hepes Buffered Saline) è stata preparata sciogliendo 5 g di Hepes, 8 g di NaCl, 0,37 g di KCl, 1 g di destrosio, 0,103 g di Na 2 HPO 4 (anidro) in 100 ml di H 2 O. Aliquota the10 X tampone HBS in 1 ml aliquote e conservare a -20 ° C. Al momento della transfezione, convertire il X 10 HBS a 2 x HBS con H 2 O (1: 5 diluizione), e portare il pH compreso tra 7,05-7,12. (Per 10 ml 2 X HBS, che di solito richiede circa 50 ml di NaOH 1M). Filtro sterilizzare il tampone HBS 2X passando attraverso un filtro Millipore 0,22 mM. CaCl tampone 2 è stata preparata sciogliendo CaCl 2 in 10 mm ad un Hepes 2M concentrazione finale. Regolare il pH a 5,8, filtro sterilizzare il buffer e conservare a 4 ° C. Procedimento: Un giorno prima della transfezione, semi di 2 x 10 6 cellule HEK293T in un 100 mm Petri-piatto, e far crescere le cellule durante la notte in 10 ml di DMEM + 10% FBS a 37 ° C, 5% di CO 2. Il giorno dopo, togliere surnatante dalle cellule e sostituirlo con 5 ml fresca DMEM + 10% FBS, continuamente le cellule di coltura per 4 ore. In un tubo di polistirene da 5 ml, aggiungere 480 microlitri di buffer HBS 2X. In un secondo tubo 5 ml in polistirolo, aggiungere 60 microlitri 2M CaCl 2 buffer, il DNA plasmidico e trasfezione di buffer TE (1 mM Tris, 25 mM EDTA, pH 8,0) per un volume totale di 480 microlitri. Per ogni Petri-piatto, plasmidi deve essere aggiunto nella proporzione di 10 mcg di PNL-GFP-RRE-SA, 7,5 mcg di pCMVΔR8.3, e 2,5 mg di pHCMV-G. Aggiungere il plasmide DNA CaCl 2 miscela goccia a goccia nella provetta 2 X HBS, e incubare a temperatura ambiente per 30 minuti. Un precipitato bene si formerà. Aggiungere il 960 microlitri della miscela goccia a goccia dalla pipetta per le cellule. Incubare a 37 ° C, 5% CO 2 durante la notte. Il giorno successivo, rimuovere il supernatante e aggiungere 10 ml di fresca DMEM + 10% FBS, e continuamente incubare le cellule a 37 ° C CO, 5% 2 durante la notte. A 48 ore dopo la transfezione, raccogliere il virus eliminando il supernatante e trasferirlo in 50 mL sterile. Aggiungere 10 ml fresca fresca FBS DMEM + 10% in ogni Petri-piatto e continuare a cultura durante la notte. Conservare il supernatante virus a 4 ° C. Continuare a raccogliere a 72 ore dopo la trasfezione raccogliendo il sopranatante. Unire tutti i surnatanti, e centrifugare il surnatante a 500 xg per 15 minuti per far sedimentare e rimuovere i detriti cellulari. Il supernatante sono stati raccolti e filtrata attraverso un filtro Millipore 0,22 mM. Il virus si è ulteriormente concentrata nella dimensione-esclusione colonne. 2. Concentrare le particelle virali e determinare titolo virale Particelle virali si sono concentrati da una dimensione di esclusione colonna (100.000 MW tagliati fuori, Centricoin). Surnatante virale è stato caricato in colonna, e centrifugati a 6.000 xga 4 ° C per 15 minuti. Surnatante concentrato virale è stato raccolto, frazionare e conservati a -80 ° C. Il titolo virale è stata determinata da infezione di un TNF-trattati, l'HIV-1 positivi linea cellulare Jacket, J1.1 7. Le cellule sono state coltivate in una piastra da 96 pozzetti a 2,5 x 10 5 cellule per ml (100 ml in totale), e infettati con 100 ml di diluito serialmente VNL-GFP-RRE-SA per una settimana. Il titolo (TCID50) della particella è stata stimata contando i pozzi GFP positivo seguendo il metodo di Reed e Muench 8. 3. Marcatura di HIV-1 Cellule positive con la particella lentivirali, VNL-GFP-RRE-SA Set up: un essere umano linea di cellule T CD4, CEM-SS, per la prima volta infettati con HIV-1. A 48 ore dopo l'infezione, le cellule sono state superinfezione con le particelle lentivirali, VNL-GFP-RRE-SA. A seguito di una superinfezione per altri due giorni, GFP-positive cellule sono state analizzate mediante citometria di flusso. Come controllo, l'HIV-1 non infette CEM-SS cellule sono state infettate con identico VNL-GFP-RRE-SA. Solo l'HIV-1-infetti le cellule CEM-SS ha dato luogo a cellule GFP positive ma non l'HIV-1 non infette CEM-SS cellule. Procedimento: Due ore prima dell'infezione, aggiungere polybrane ad una concentrazione finale di 4 mg / ml. Contare le celle e prendere 2 x 10 5 cellule per ogni infezione. Infettare le cellule con 200 ng (p24) del virus HIV-1 NL4-3 per 2 ore. Lavaggio cellule centrifugare a 300 xg per 10 minuti, risospenderecellule in 2 x 10 5 cellule / ml, e la cultura a 37 ° C per 48 ore. Contare le celle e prendere 2 x 10 5 cellule per infezione da VNL-GFP-RRE-SA. Aggiungere 100 ml di VNL-GFP-RRE-SA e incubare a 37 ° C durante la notte. Lavare le cellule e risospendere in 2 x 10 5 cellule / ml. Effettuare analisi di citometria a flusso a 48 dopo una superinfezione ore. Cellule infette sono state pellettato e risospese in 500 ml paraformaldehede 1%, incubate a temperatura ambiente per 20 minuti, e poi analizzati in un analizzatore FACScan (Becton Dickinson). 4. Rappresentante Risultati Se gli esperimenti vengono eseguiti con successo, una popolazione consistente GFP sarà rilevata in HIV-1-infetti le cellule CEM-SS dal citometro a flusso, mentre, nel controllo, le cellule GFP positive non verranno rilevati in HIV-1 non infette CEM-SS cellule. Se gli esperimenti vengono eseguiti con successo, il Rev-dipendente vettori lentivirali, VNL-GFP-RRE-SA, permetterà la rilevazione altamente specifici di replicazione HIV in popolazioni di cellule viventi, attraverso la misurazione della proteina verde fluorescente (GFP) espressione. In questo esempio, raccolte CEM-SS cellule sono state colorate con un PE-anticorpo marcato topo topo monoclonale contro CD24, HSA, e quindi analizzati su un citometro di flusso sia per HSA e di espressione della GFP. Figura 1. Come si vede qui, una popolazione GFP consistente è stata rilevata in HIV-1-cellule infettate con superinfezione VNL-GFP-RRE-SA (Figura 1c). Al contrario, le cellule GFP positive non sono state rilevate in entrambi i non infetti da HIV-1 CEM-SS cellule senza superinfezione lentivirali (figura 1a) o di HIV-1 le cellule non infette con superinfezione lentivirali (Figura 1b).

Discussion

Come per il precedente sviluppato Tat-dipendente vettori di espressione, il sistema Rev qui descritto è uno sfruttamento di un processo evoluto HIV. L'inclusione di Rev-dipendenza rende l'LTR-based vettore di espressione altamente dipendente dalla presenza di replicazione dell'HIV. L'applicazione di questo vettore come riportato qui, un dipendente del virus HIV-reporter, offre un approccio nuovo romanzo di identificare le cellule HIV-positive. Il vettore consente di esame delle cellule viventi, può esprimere qualsiasi gene per la sperimentazione clinica o di base, e come uno pseudo-digitato lentivirus ha accesso alla maggior parte dei tipi di cellule e tessuti.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Il lavoro è stato sostenuto in parte da Public Health Service concedere 1R01AI081568 dal NIAID a YW e dalle generose donazioni dei donatori e piloti del giro 2009 NYCDC Aids organizzato da M. Rosen e Day2 Inc.

Materials

Material Name Type Company Catalogue Number Comment
Biosafety Cabinet        
37°C 5%CO2 incubator        
Flow cytometer     FACSCalibur  
Centrifuge   Beckman Allega™6KR  
4°C regrigerator        
-20°C refrigerator        
-80°C refrigerator        
Cell counter   Nexcelom Cellometer™ AutoT4  
HEK293T cell line   NIH    
CEM-SS cell line   NIH    
Jurkat cell line J1.1   NIH    
DMEM   Invitrogen 11965-118  
RPMI 1640   Invitrogen 21870  
HI FBS   Invitrogen 10438-018  
HIV-1NL4-3       prepared by tranfsection of HeLa cells with cloned proviral DNA
pNL-GFP-RRE       copmlete deletion of all HIV ORFs of pNL4-3
pNL-GFP-RRE-SA       Insert HIV-1 A5 and D4 into pNL-GFP-RRE
pCMVΔ8.2       provided by Dr. Dider Trono
pHCMV-G        
10 x HBS (Hepes Buffered Saline)   Invitrogen 11344-041  
2M CaCl2 buffer   Invitrogen S-013-154-10  
1% paraformaldehy   Sigma Aldrich 158127  
Bleach        
50ml Falcon tubes   BD Bioscience 358206  
5ml round bottom tubes   BD Bioscience 352063  
0.45μM Millipore filter   Millipore SLHA033SS  
0.20μM Millipore filter   Millipore SLFG85000  
100mm Petri-dish   Sigma Aldrich CLS430588  
Size-exclusion column (100,000MW cut off)   SartoriuStedim biotech VS2041  
2ml frozen tube   Axygen SCT-200  
96-well plate   BD Bioscience 353227  
1.7mL Microcentrifuge Tube   Axygen MCT- 175-C  

References

  1. Garcia, J. A., Wu, F. K., Mitsuyasu, R., Gaynor, R. B. Interactions of cellular proteins involved in the transcriptional regulation of the human immunodeficiency virus. EMBO Journal. 6, 3761-3770 (1987).
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  8. Reed, L. J., Muench, H. A simple method of estimating fifty percent endpoints. American Journal of Hygiene. 27, 493-497 (1938).

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Cite This Article
Guo, J., Enos, C., Wu, Y. Specific Marking of HIV-1 Positive Cells using a Rev-dependent Lentiviral Vector Expressing the Green Fluorescent Protein. J. Vis. Exp. (43), e2198, doi:10.3791/2198 (2010).

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