Конкретные Маркировка ВИЧ-1-положительных клеток использованием Rev-зависимый лентивирусов Векторный выражая зеленый флуоресцентный белок

1. Трансфекция плазмиды для производства Rev-зависимый лентивирусов Частицы Установка: Rev-зависимый GFP лентивирусов вектор, НЛП-GFP-РРЭ-SA, был описан ранее 4,5,6. Чтобы собрать в вирусную частицу, плазмиду contransfected в HEK293 Т-клеток с ВИЧ-1 упаковка построить, pCMVΔ8.2 (любезно предоставлены доктором Dider Trono), и плазмиды проведения VSV-G гликопротеин (pHCMV-G) . Трансфекции было проведено с использованием метода фосфата кальция. Подготовка буферов: 10 х HBS (Hepes солевой буфер) готовили растворением 5 г Hepes, 8 г хлористого натрия, 0,37 г хлорида калия, 1 г декстрозы, 0,103 г Na 2 HPO 4 (безводный) в 100 мл H 2 O. Алиготе the10 X HBS буфер в 1 мл аликвоты и хранят при температуре -20 ° C. Во время трансфекции, конвертировать 10 X HBS до 2 х HBS с H 2 O (1: 5 разведение), а также регулирования рН в пределах от 7,05 – 7,12. (На 10 мл 2 х HBS, как правило, требует примерно 50 мкл 1М NaOH). Фильтры стерилизовать 2X буфера HBS, проходя через 0,22 мкм Millipore фильтр. CaCl 2 буфера было сделано путем растворения CaCl 2 в 10 Hepes мМ до окончательного 2М концентрации. Отрегулируйте рН до 5,8, фильтр стерилизуют буфера и хранить при 4 ° C. Порядок действий: За день до трансфекции, семена 2 х 10 6 HEK293T клеток в 100 мм-Петри блюдо, и вырастить клетки на ночь в 10 мл DMEM + 10% ЭТС при 37 ° C, 5% СО 2. На следующий день, удалить супернатант из клетки и замените 5 мл свежей DMEM + 10% FBS, непрерывно культуры клеток в течение 4 часов. В 5 мл полистирола трубки, добавляют 480 мкл буфера HBS 2X. Во второй трубки полистирола 5 мл, добавить 60 мкл 2М CaCl 2 буфера, плазмиды ДНК и трансфекции ТЕ буфера (1 мМ трис, 25 мМ ЭДТА, рН 8,0) в общем объеме 480 мкл. Для каждого Петри блюдо, плазмиды должны быть добавлены в соотношении 10 мкг НЛП-GFP-РРЭ-SA, 7,5 мкг pCMVΔR8.3 и 2,5 мг pHCMV-G. Добавить плазмиды ДНК-CaCl 2 смеси по каплям 2 трубками X HBS, и инкубировать при комнатной температуре в течение 30 минут. Мелкий осадок будет форма. Добавить 960 мкл смеси по каплям пипеткой к клеткам. Инкубировать при 37 ° C, 5% СО 2 за одну ночь. На следующий день, удалите супернатант и добавить 10 мл свежей DMEM + 10% FBS, и постоянно инкубации клеток при 37 ° С, 5% СО 2 за одну ночь. Через 48 часа после трансфекции, урожай вирус удаляя супернатант и передачи его в 50 мл стерильные пробирки. Добавьте свежие 10 мл свежей DMEM + 10% FBS в каждой Петри блюдо и продолжать культуры в одночасье. Магазин вирус супернатант при 4 ° C. Продолжайте урожай в 72 часа после трансфекции, собирая супернатант. Смешайте все супернатанты, и центрифуга супернатанты на уровне 500 мкг в течение 15 минут для осаждения и удаления ячейки мусора. Супернатант собирали и фильтруют через 0,22 мкм Millipore фильтр. Вирус был также сосредоточен через гель-столбцов. 2. Концентрат вирусных частиц и определить вирусную Титр Вирусные частицы были сосредоточены на гель-колонки (100 000 МВт отрезаны, Centricoin). Вирусный супернатант загружается в колонну, и центрифугировали при 6000 мкг при 4 ° С в течение 15 минут. Концентрированный вирусных супернатант собирали, аликвоты и хранили при температуре -80 ° C. Вирусный титр определяется заражения TNF-лечение, ВИЧ-1 положительных клеточной линии куртка, J1.1 7. Клетки культивировали в 96 ячейках на уровне 2,5 х 10 5 клеток на мл (100 мл общего объема), а также инфицированы 100 мл последовательно разбавлены VNL-GFP-РРЭ-SA в течение недели. Титр (TCID50) частицы оценивалась путем подсчета GFP положительные скважин по методу Рида и Мюнх 8. 3. Маркировка ВИЧ-1-положительных клеток с лентивирусов частиц, VNL-GFP-РРЭ-SA Установка: человеческий Т клеток CD4 линии, CEM-SS, впервые инфицированных ВИЧ-1. Через 48 часа после инфекции, клетки superinfected с лентивирусов частиц, VNL-GFP-РРЭ-SA. После суперинфекции в течение еще двух дней, GFP-положительных клеток анализировали с помощью проточной цитометрии. В качестве контроля, ВИЧ-1 неинфицированных CEM-SS клетки одинаково инфицированы VNL-GFP-РРЭ-SA. Только ВИЧ-1-инфицированных CEM-SS клетки породили GFP-положительных клеток, но не ВИЧ-1 неинфицированных CEM-SS клеток. Порядок действий: За два часа до инфекции, добавьте polybrane до конечной концентрации 4 мг / мл. Граф клеток и принимать по 2 х 10 5 клеток для каждой инфекции. Инфицировать клетки с 200 нг (p24) ВИЧ-1 NL4-3 в течение 2 часов. Стиральная клеток центрифуге при 300 мкг в течение 10 минут, ресуспендируютклетки в 2 х 10 5 клеток / мл и культуры при 37 ° С в течение 48 часов. Граф клеток и принимать по 2 х 10 5 клеток на инфекцию VNL-GFP-РРЭ-SA. Добавить 100 мл VNL-GFP-РРЭ-SA и инкубировать при температуре 37 ° С в течение ночи. Вымойте клетки и ресуспендируют в 2 х 10 5 клеток / мл. Выполнить анализ проточной цитометрии в 48 часа после суперинфекции. Зараженные клетки осаждали и ресуспендировали в 500 мл 1% paraformaldehede, инкубируют при комнатной температуре в течение 20 минут, а затем анализировали на анализаторе FACScan (Becton Дикенсон). 4. Представитель Результаты Если эксперименты успешно, значительное население GFP будет обнаружен у ВИЧ-1-инфицированных CEM-SS клеток потока цитометр, тогда как в контрольной, GFP-положительных клеток, не будет обнаружена ВИЧ-1 неинфицированных CEM-SS клеток. Если эксперименты успешно, Rev-зависимый лентивирусов вектор, VNL-GFP-РРЭ-SA, позволит весьма специфической детекции репликации ВИЧ в живую клетку населения, посредством измерения зеленая флуоресценция белка (GFP) выражении. В этом примере собрано CEM-SS клетки окрашивали РЕ-меченого крысиного моноклонального антитела против CD24 мыши, ЧСА, а затем анализировали на проточном цитометре для АСП и GFP выражения. Рисунок 1. Как показано здесь, значительное население GFP был обнаружен у ВИЧ-1-инфицированных клеток superinfected с VNL-GFP-РРЭ-SA (рис. 1в). В противоположность этому, GFP-положительных клеток не были обнаружены ни в HIV-1 неинфицированных CEM-SS клеток без лентивирусов суперинфекции (рис. 1а) или ВИЧ-1 незараженных клеток с лентивирусов суперинфекции (рис. 1b).