그린 형광 단백질을 표현 레브 종속 Lentiviral 벡터를 사용하여 HIV - 1 양성 세포의 특정 마킹

1. 레브 의존 Lentiviral 입자의 생산을위한 Plasmids의 Transfection 설정 : 레브 종속 GFP lentiviral 벡터, pNL – GFP – RRE – SA는, 이전 4,5,6 설명했다. 바이러스 입자로 조립하려면, 플라스미드는 HIV – 1 포장 구조, pCMVΔ8.2 (친절 박사 Dider Trono에서 제공)와 HEK293 T 세포에 contransfected 및 플라스미드는 VSV – G의 당단백질 (pHCMV – G)를 가지고 가던 중이었습니다 . transfection은 인산 칼슘 방법을 사용하여 실시되었다. 버퍼의 준비 : 10 X HBS는 (Hepes가 살린 버퍼) Hepes 5 G를 해소하여 준비했습니다 8 NaCl의 g, 100 ML에 나 2 HPO 4 (무수)의 KCl, 덱스 트로 오스의 1g, 0.103 g의 0.37 g H 2 O. 나누어지는 the10 X HBS의 한 ML의 aliquots에 버퍼와 -20 ° C.에 저장 transfection의 당시 H 2 O (1 : 5 희석) 2 X HBS에 10 X HBS로 변환하고, 사이에 7.05로 산도를 조정 – 7.12. (10 ML 2 X HBS를 위해, 그것은 보통 1M NaOH의 약 50 μL가 필요합니다.) 0.22 μm의 Millipore 필터를 통과하여 2X HBS 버퍼를 소독 필터. CaCl 2 버퍼는 최종 농도 2M 10 MM의 Hepes에 CaCl 2를 용해하여 만들어졌다. 5.8으로 산도를 조절, 4에서 버퍼와 저장소를 소독 필터 ° C.를 절차 : 이전 transfection 한 일, 종자 2 X 10 6 HEK293T 페트리 – 요리 100mm의 세포, 37 10 ML DMEM + 10% FBS에서 야간 세포를 성장 ° C, 5 % CO 2. 그 다음날, 세포의 표면에 뜨는 제거 5 ML 신선한 DMEM + 10% FBS, 4 시간 동안 지속적으로 문화 전지로 교체하십시오. 5 ML의 폴리스티렌 관에서 480 μL 2X HBS 버퍼를 추가합니다. 두 번째 5 ML의 폴리스티렌 튜브에 480 μL의 총 부피 60 μL 2M CaCl 2 버퍼, 플라스미드 DNA 및 transfection TE 버퍼를 (1 MM 트리스, 25 MM EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산), 산도 8.0)을 추가합니다. 각 페트리 – 요리, plasmids은 pNL – GFP – RRE – SA, pCMVΔR8.3의 7.5 μg, 그리고 pHCMV – G 2.5 MG 10 μg의 비율에 추가되어야합니다. 2 X HBS 튜브에 dropwise 플라스미드 DNA – CaCl 2 혼합물을 추가하고 30 분 동안 상온에서 알을 품다. 좋은 침전물이 형성됩니다. 세포에 피펫으로 dropwise 혼합물의 960 μL를 추가합니다. ° C, 5 % CO 2 밤새 37 알을 품다. 다음날, 뜨는을 제거하고 10 ML 신선한 DMEM + 10% FBS를 추가하고, 지속적으로 37 ° C, 5 % CO 2 밤새에서 세포를 품어. 48 시간 게시 transfection에서 수확 뜨는을 제거 50 ML 멸균 튜브에 전송하여 바이러스. 각 페트리 – 그릇에 신선한 10 ML 신선한 DMEM + 10% FBS를 추가하고 야간 문화를 계속합니다. 4 바이러스 뜨는을 저장 ° C. 뜨는를 수집하여 72시간 게시물 transfection에 수확을 계속합니다. 모든 supernatants를 결합하고, 펠릿 15 분 500 XG에서 supernatants를 원심과 세포 잔해를 제거합니다. 뜨는은 0.22 μm의 Millipore 필터를 통해 수집 및 필터링되었습니다. 바이러스는 더 크기 배제 컬럼을 통해 집중되었다. 2. 바이러스성 입자를 집중 바이러스성 Titer 결정 바이러스성 입자는 크기 제외 열 (100,000 MW가 잘려, Centricoin)에 의해 집중되었다. 바이러스성 뜨는은 열에로드, 4 15 분 동안 ° C에서 6,000 XG에 centrifuged했다. 집중 바이러스 뜨는가 수집 aliquoted하고, -80 ° C.에 저장된 바이러스 titer는 TNF – 처리, HIV – 1 양성 재킷 세포 라인, J1.1 7 감염에 의해 결정되었다. 전지는 ML 당 2.5 X 10 5 셀 (100 ML 전체 볼륨)에서 96 접시에 잘 교양하고, 일주일 동안 순차적으로 희석 vNL – GFP – RRE – SA 100 ML에 감염되었습니다. 입자의 titer (TCID50)는 리드와 Muench 8 방법 다음과 같은 GFP 긍정적인 우물을 계산하여 추정되었다. 3. 마킹 HIV – 1 Lentiviral 입자와 함께 긍정적인 세포, vNL – GFP – RRE – SA 설정 : 인간의 CD4 T 세포 라인, CEM – SS는, 먼저 HIV – 1에 감염되었습니다. 48 시간 이후 감염에서, 세포는 lentiviral 입자 vNL – GFP – RRE – SA와 함께 superinfected되었습니다. 또 이틀 동안 superinfection 따라 GFP 양성 세포 유동세포계측법에 의해 분석되었다. 컨트롤로서, HIV – 1 감염되지 않은 CEM – SS 세포는 동일 vNL – GFP – RRE – SA에 감염되었습니다. 단지 HIV – 1에 감염된 CEM – SS 세포는 HIV – 1 감염되지 않은 CEM – SS 세포를 GFP 양성 세포에 상승했다지만. 절차 : 감염 전에 두 시간은 최종 농도 4 MG / ML에 polybrane를 추가합니다. 세포를 카운트하고 각 감염 2 × 10 5 세포를 가져가라. 2 시간 동안 HIV – 1 NL4 – 3 200 NG (p24)의 세포를 감염. resuspend은 10 분 300 XG에서 원심 분리기에 의해 세포를 세척48 시간 37 2 X 10 5 세포 / ML, 문화에 세포 ° C. 세포를 카운트하고 vNL – GFP – RRE – SA와 함께 감염 당 2 × 10 5 세포를 가져가라. ° C 야간 37 vNL – GFP – RRE – SA와 부화 100 ML을 추가합니다. 세포를 씻어 2 × 10 5 세포 / ML에 resuspend. 48 시간 게시 superinfection에서 유동세포계측법 분석을 수행합니다. 감염된 세포는 pelleted 20 분 실온에서 incubated 500 ML 1 % paraformaldehede로 resuspended되었고, 다음 FACScan 분석기 (백톤 디컨슨)에서 분석했다. 4. 대표 결과 실험이 성공적으로 수행하는 경우에는 컨트롤에 GFP 양성 세포가 HIV – 1 감염되지 않은 CEM – SS에서 검색되지 않습니다, 반면, 상당한 GFP의 인구는, 흐름 cytometer에 의해 HIV – 1에 감염된 CEM – SS 세포에 감지됩니다 세포. 실험이 성공적으로 수행하는 경우, 레브 의존 lentiviral 벡터, vNL – GFP – RRE – SA는 녹색 형광 단백질 (GFP) 표현의 측정을 통해 세포 인구 생활의 복제 HIV의 매우 구체적인 검출을 허용합니다. 이 예제에서 수확 CEM – SS 세포는 마우스 CD24, HSA에 대한 PE – 라벨 쥐의 단클론 항체와 스테인드되었고, 다음 HSA 및 GFP의 표현 모두에 대해 흐름 cytometer에 분석했다. 그림 1. 여기 같이, 상당한 GFP의 인구가 vNL – GFP – RRE – SA (그림 1C)와 superinfected HIV – 1에 감염된 세포에서 발견되었다. 대조적으로, GFP 양성 세포는 lentiviral superinfection (그림 1A) 또는 HIV – 1 lentiviral superinfection (그림 1B)와 감염되지 않은 세포.없이도 HIV – 1 감염되지 않은 CEM – SS 세포에서 발견되지 않았습니다