סימון ספציפיות של HIV-1 תאים חיוביים באמצעות וקטור Rev-מותנה lentiviral מבטא את חלבון פלואורסצנטי ירוק

1. Transfection של פלסמידים עבור הפקה של Rev-מותנה חלקיקים lentiviral הגדרת: Rev-GFP תלוי וקטור lentiviral, pNL-GFP-RRE-SA, תוארה בעבר 4,5,6. כדי להרכיב לתוך חלקיק נגיפי, הפלסמיד היה contransfected לתוך HEK293 בתאי T לבנות עם HIV-1 אריזה, pCMVΔ8.2 (בתנאי בחביבות על ידי ד"ר Dider Trono), וכן פלסמיד שנשא את גליקופרוטאין VSV-G (pHCMV-G) . Transfection בוצע בשיטת סידן פוספט. הכנת מאגרים: 10 X בהרוורד (Hepes בופר) הוכנה על ידי המסת 5 גרם של Hepes, 8 גרם של NaCl, 0.37 גרם של KCl, 1 גרם דקסטרוז, 0.103 גרם Na 2 HPO 4 (anhydrous) ב 100 מ"ל של H 2 O. The10 Aliquot X בהרוורד חיץ לתוך 1 מ"ל aliquots ולאחסן ב -20 ° C. בזמן transfection, להמיר את 10 X 2 X בהרוורד כדי בהרוורד עם H 2 O (1: 5 דילול), ולהתאים את ה-pH על בין 7.05-7.12. (ל -10 מ"ל 2 X בהרוורד, זה בדרך כלל דורש כ 50 μL של 1M NaOH). סנן לעקר את החיץ 2X בהרוורד על ידי עובר דרך 0.22 מיקרומטר Millipore הסינון. חיץ CaCl 2 נעשתה על ידי המסת CaCl 2 ב 10 Hepes מ"מ עד 2M ריכוז הסופי. התאם ל-pH 5.8, מסנן לעקר את החיץ ולאחסן ב 4 ° C. נוהל: יום אחד לפני transfection, זרע 2 x 10 6 תאים HEK293T ב 100 מ"מ, צלחת פטרי, ולגדל תאים לילה 10 מ"ל DMEM + 10% FBS על 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2. למחרת, להסיר supernatant מתאי ולהחליף עם 5 מ"ל טרי DMEM + 10% FBS, התרבות תאים ברציפות במשך 4 שעות. בתוך צינור קלקר 5 מ"ל, להוסיף 480 μL חיץ 2X בהרוורד. בתוך צינור פוליסטירן השני 5 מ"ל, להוסיף 60 μL 2M CaCl 2 חיץ, ה-DNA פלסמיד, ו transfection TE חיץ (1 mM טריס, 25 mM EDTA, pH 8.0) עד נפח כולל של 480 μL. עבור צלחת פטרי כל פלסמידים יש להוסיף ביחס של 10 מיקרוגרם של pNL-GFP-RRE-SA, 7.5 מיקרוגרם של pCMVΔR8.3, ו 2.5 מ"ג של pHCMV-G. מוסיפים את פלסמיד דנ"א CaCl 2 dropwise תערובת של הצינור 2 בהרוורד X, דגירה בטמפרטורת החדר למשך 30 דקות. המשקע בסדר יהוו. מוסיפים את μL 960 של התערובת dropwise ידי פיפטה אל התאים. לדגור על 37 ° C CO, 5% 2 לילה. למחרת, להסיר את supernatant ולהוסיף טרי 10 מ"ל DMEM + 10% FBS, ברציפות דגירה התאים ב 37 ° C CO, 5% 2 לילה. בשלב transfection 48 שעות לכתוב, הקציר וירוס על ידי הסרת supernatant והעברתו לתוך צינורות 50 מ"ל סטרילי. הוסף 10 מ"ל טרי טרי DMEM FBS + 10% לתוך צלחת פטרי כל ולהמשיך תרבות בין לילה. חנות supernatant וירוס ב 4 ° C. המשך הקציר transfection 72 שעות שלאחר ידי איסוף supernatant. מערבבים את כל supernatants ו בצנטריפוגה supernatants XG ב 500 במשך 15 דקות כדי גלולה ולסלק פסולת התא. Supernatant נאספו מסונן באמצעות מסנן Millipore 0.22 מיקרומטר. הווירוס היה מרוכז יותר באמצעות גודל הדרה עמודות. 2. תתרכז חלקיקים נגיפיים ולקבוע titer ויראלי חלקיקים נגיפיים רוכזו על ידי טור בגודל הרחקה (100,000 מגוואט מנותקים, Centricoin). Supernatant ויראלי נטען לתוך הטור, ו centrifuged XG ב 6000 ב 4 מעלות צלזיוס במשך 15 דקות. Supernatant ויראלי מרוכז נאסף, aliquoted, ומאוחסנים ב -80 ° C. Titer ויראלי נקבע על ידי זיהום של TNF-שטופלו, HIV-1 קו התא חיובי Jacket, J1.1 7. היו תאים בתרבית בצלחת 96 גם ב 2.5 x 10 5 תאים לכל מ"ל (100 מ"ל סה"כ נפח), וכן נגוע 100 מ"ל של דילול סדרתי vNL-GFP-RRE-SA במשך שבוע. כייל (TCID50) של החלקיקים הוערך על ידי ספירת בארות GFP חיובית בעקבות השיטה של ​​ריד Muench 8. 3. סימון HIV-1 תאים חיובי עם החלקיקים lentiviral, vNL-GFP-RRE-SA הגדרת: תא T מסוג CD4 אנושי קו, CEM-SS, היה נגוע הראשון עם HIV-1. ב 48 השעות שלאחר הזיהום, התאים היו superinfected עם חלקיקי lentiviral, vNL-GFP-RRE-SA. בעקבות superinfection עוד יומיים, GFP חיובי תאים נותחו על ידי cytometry הזרימה. כמו שליטה, HIV-1 נגוע CEM-SS התאים נדבקו זהה עם vNL-GFP-RRE-SA. רק ב-HIV-1-נגועים CEM-SS תאים הולידה את ה-GFP בתאים חיוביים אך לא HIV-1 נגוע CEM-SS תאים. נוהל: שעתיים לפני ההדבקה, להוסיף polybrane לריכוז סופי 4 מ"ג / מ"ל. ספירת תאים ולקחת 2 x 10 5 תאים עבור כל זיהום. להדביק תאים עם נ"ג 200 (p24) של HIV-1-3 NL4 למשך 2 שעות. כביסה תאים על ידי צנטריפוגה XG ב 300 במשך 10 דקות, resuspendתאים לתוך 2 x 10 5 תאים / מ"ל, והתרבות 37 מעלות צלזיוס למשך 48 שעות. ספירת תאים ולקחת 2 x 10 5 תאים לכל זיהום vNL-GFP-RRE-SA. מוסיפים 100 מ"ל של vNL-GFP-RRE-SA ו לדגור על 37 מעלות צלזיוס למשך הלילה. שטפו תאים resuspend לתוך 2 x 10 5 תאים / מ"ל. בצע ניתוח תזרים cytometry ב superinfection 48 שעות הודעה. תאים נגועים היו pelleted ו resuspended לתוך paraformaldehede 500 מ"ל 1%, מודגרות בטמפרטורת החדר למשך 20 דקות, ניתח אז על נתח FACScan (בקטון דיקנסון). 4. נציג תוצאות אם הניסויים מבוצעים בהצלחה, אוכלוסייה גדולה של GFP יזוהו בתאים HIV-1-נגועים CEM-SS על ידי cytometer את הזרימה, בעוד שליטה, התאים GFP חיובי לא יזוהו ב HIV-1 נגוע CEM-SS תאים. אם הניסויים מבוצעים בהצלחה, וקטור Rev-מותנה lentiviral, vNL-GFP-RRE-SA, יאפשר זיהוי ספציפי מאוד של איידס משכפלים לחיות אוכלוסיות תאים, באמצעות מדידה של חלבון פלואורסצנטי ירוק הביטוי (GFP). בדוגמה זו, שנקטפו CEM-SS תאים הוכתמו נוגדן PE-שכותרתו עכברוש חד שבטי כנגד CD24 העכבר, HSA, ונותחו לאחר מכן על cytometer זרימה הן HSA וביטוי GFP. באיור 1. כפי שמוצג כאן, אוכלוסייה גדולה של GFP זוהה HIV-1-נגועים בתאי superinfected עם vNL-GFP-RRE-SA (איור 1 ג'). לעומת זאת, התאים GFP חיובי לא התגלו או CEM-SS תאים HIV-1 נגוע ללא superinfection lentiviral (איור 1 א) או HIV-1 לתאים נגוע עם superinfection lentiviral (איור 1b).