Summary

Selección de los aptámeros de amiloide β-proteínas, el agente causante de la enfermedad de Alzheimer

Published: May 13, 2010
doi:

Summary

Los aptámeros son ribo-/deoxyribo-oligonucleotides corto seleccionado por<em> In-vitro</em> Métodos de la evolución basada en la afinidad de un objetivo específico. Los aptámeros son herramientas de reconocimiento molecular con la versatilidad de las aplicaciones terapéuticas, diagnósticas y de investigación. Demostramos métodos para la selección de aptámeros de amiloide β-proteínas, el agente causal de la enfermedad de Alzheimer.

Abstract

La enfermedad de Alzheimer (EA) es una enfermedad progresiva, dependiente de la edad, enfermedades neurodegenerativas con un curso insidioso que hace que su diagnóstico presintomático difícil 1. Diagnóstico del TDA definitiva se logra sólo postmortem, estableciendo así el diagnóstico presintomático, precoz de la EA es crucial para desarrollar y administrar tratamientos eficaces 2,3.

Β-amiloide, proteína (Aß) es fundamental para la patogénesis de la EA. Asambleas soluble, Aß oligoméricas se cree que afecta a la neurotoxicidad de la disfunción sináptica y la pérdida de neuronas en el año 4,5. Diversas formas de Aß soluble asambleas se han descrito, sin embargo, sus interrelaciones y la importancia de la etiología y la patogénesis de AD son complejos y no se entiende bien 6. Herramientas específicas para el reconocimiento molecular pueden desentrañar las relaciones entre los conjuntos de Aß y facilitar la detección y caracterización de estos conjuntos de principios en el curso de la enfermedad antes de aparecer los síntomas. Reconocimiento molecular comúnmente se basa en anticuerpos. Sin embargo, una clase alternativa de herramientas de reconocimiento molecular, aptámeros, ofrece importantes ventajas con respecto a los anticuerpos 7,8. Los aptámeros son oligonucleótidos generados por in-vitro de selección: la evolución sistemática de ligandos por enriquecimiento exponencial (SELEX) 9,10. SELEX es un proceso iterativo que, al igual que la evolución darwiniana, permite la selección, amplificación, el enriquecimiento y la perpetuación de una propiedad, por ejemplo, ávida, específica, de unión al ligando (aptámeros) o la actividad catalítica (ribozimas y ADNzimas).

Pesar de la aparición de aptámeros como herramientas de la biotecnología moderna y la medicina 11, han sido poco utilizados en el campo de amiloide. Pocos o ARN aptámeros ssDNA han sido seleccionados contra las distintas formas de proteínas priónicas (PrP) 12-16. Un aptámero ARN generados contra PrP bovina recombinante ha demostrado que reconocer bovina PrP-β de 17 años, soluble, oligómero, β-hoja-rica variante de conformación de larga duración PrP que forma fibrillas de amiloide 18. Aptámeros generado con las formas monoméricas y varios de β fibrilar se encontraron 2-microglobulina2 m) para enlazar las fibrillas de ciertas proteínas amiloidogénica otros, además de las fibrillas de β 2 m 19. Ylera et al. describe aptámeros de ARN seleccionados en contra inmovilizado monoméricas Aβ40 20. Inesperadamente, estos aptámeros obligado fibrilar Aβ40. En conjunto, estos datos plantean varias cuestiones importantes. ¿Por qué aptámeros seleccionado frente a las proteínas monoméricas reconocer sus formas poliméricas? Podría aptámeros contra las formas monoméricas y / o de las proteínas oligoméricas amiloidogénica se obtiene? Para abordar estas cuestiones, hemos intentado seleccionar aptámeros para covalentemente estabilizado oligoméricas Aβ40 21 generados usando foto-inducido de entrecruzamiento de las proteínas sin modificar (picup) 22,23. Similar a los hallazgos previos 17,19,20, estos aptámeros reaccionaron con fibrillas de Aß y otras proteínas amiloidogénica probable que el reconocimiento de un amiloide potencialmente estructural común aptatope 21. A continuación, presentamos la metodología SELEX utilizados en la producción de estos aptámeros 21.

Protocol

Parte 1: preparación de la proteína y el cross-linking Inicialmente, la proteína utilizada para SELEX se trata previamente con 1,1,1,3,3,3-hexafluoro-2-propanol (HFIP) para obtener homogénea, global sin preparación, como se describió previamente 23. Este paso es necesario porque preformados agregados inducir la agregación de las proteínas de rápida amiloidogénica, resultando en una mala reproducibilidad experimental 24, y no son deseables para la selección de a…

Discussion

El punto de partida del proceso SELEX es la síntesis de oligonucleótidos de una biblioteca al azar por lo general con 10 12 -10 15 secuencias. En el ADN SELEX, esta biblioteca se utiliza inmediatamente después de una piscina ssDNA se genera, mientras que en el ARN SELEX, ha demostrado aquí, la biblioteca de ADN de cadena simple se convierte primero en un grupo de ARN enzimáticamente por la transcripción in vitro. Entonces, SELEX se realiza iterativamente mediante el cual cada ciclo c…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Este trabajo fue apoyado por becas AG030709 de NIH / NIA y 07-65798 del Departamento de Salud de California. Reconocemos Margaret M. Condron para la síntesis de péptidos y análisis de aminoácidos, la Dra. Elizabeth F. Neufeld para ayudar y apoyar a los pasos iniciales del proyecto, el Dr. Chi-Hong Chen B. de proporcionar apoyo y reactivos, y el Dr. Andrew D. . Ellington útil para los debates.

Materials

Material Name Type Company Catalogue Number Comment
Aβ40   UCLA Biopolymers Laboratory   Lyophilized powder
MX5 Automated-S Microbalance   Mettler Toledo    
Silicon-coated, 1.6-ml tubes   Denville Scientific C19033 or C19035  
1,1,1,3,3,3-hexafluoro-2-propanol (HFIP)   TCI America H0424 Use in a fume hood.
Ammonium persulfate   Sigma A-7460 Vortex until the solution is clear. APS is prepared freshly each time and should be used within 48 h.
Tris(2,2-bipridyl)dichlororuthenium(II) hexahydrate   Sigma 224758-1G Vortex until the solution is clear. Cover the RuBpy tube with foil to protect the reagent from ambient light. RuBpy is prepared freshly each time and should be used within 48 h.
Dithiothreitol (DTT)   Sigma 43815  
D-Salt™ Excellulose™ desalting columns   Thermo Scientific 20449  
Ammonium acetate   Fisher Scientific A637-500  
Silicon-coated, 0.6-ml tubes   Denville Scientific C19063  
Novex Tricine Gels (10–20%)   Invitrogen EC6625B0X 10-well; mini size (8 cm X 8 cm); 25 μl loading volume per well; separation range 5 kDa to 40 kDa
Quartz cuvette   Hellma 105.250-QS  
Beckman DU 640 spectrophotometer   Beckman    
ssDNA library   Integrated DNA Technologies Custom-ordered The library was designed to contain 49 random nucleotides flanked by two constant regions containing primer-binding and cloning sites: 5′-TAA TAC GAC TCA CTA TAG GGA ATT CCG CGT GTG C (N:25:25:25:25%) (N)49 G TCC GTT CGG GAT CCT C-3′
Taq DNA polymerase   USB Corporation 71160 Recombinant Thermus aquaticus DNA Polymerase supplied with 10× PCR Buffer and a separate tube of 25 mM MgCl2 for routine PCR.
PCR Nucleotide Mix, 10 mM solution   USB Corporation 77212 (10 mM each dATP, dCTP, dGTP, dTTP)
Forward primer   Integrated DNA Technologies Custom-ordered 5′-TAA TAC GAC TCA CTA TAG GGA ATT CCG CGT GTG C-3′
Reverse primer   Integrated DNA Technologies Custom-ordered 5′-GAG GAT CCC GAA CGG AC-3′
Thermal cycler   Denville Scientific Techne TC-312  
QIAquick PCR Purification Kit (50)   QIAGEN 28104  
Agarose   Denville Scientific CA3510-8  
Conical, sterile 1.6-ml tubes with caps attached with O-rings   Denville Scientific C19040-S  
RiboMAX™ Large Scale RNA Production System–T7   Promega P1300 The kit contains: 120 μl Enzyme Mix (RNA polymerase, recombinant RNasin® ribonuclease inhibitor and recombinant inorganic pyrophosphatase); 240 μl transcription 5 buffer; 100 μl each of 4 rNTPs, 100 mM; 110 U RQ1 RNase-free DNase, 1 U/μl; 10 μl linear control DNA, 1 mg/ml; 1 ml 3M sodium acetate (pH 5.2); 1.25 ml nuclease-Free water
α-32P-cytidine 5′-triphosphate, 250 μCi (9.25 MBq),   Perkin Elmer BLU008H250UC Specific Activity: 3000 Ci (111 TBq)/mmol, 50 mM Tricine (pH 7.6)
Citrate-saturated phenol:chloroform:isoamyl alcohol (125:24:1, pH 4.7)   Sigma (Fluka) 77619  
Chloroform:Isoamyl alcohol (24:1)   Sigma C0549  
Absolute ethanol for molecular biology   Sigma E7023  
Z216-MK refrigerated microcentrifuge   Denville Scientific C0216-MK  
illustra ProbeQuant™ G-50 Micro Columns   GE Healthcare Obtained from Fisher Scientific (45-001-487) Prepacked with Sephadex™ G-50 DNA Grade and pre-equilibrated in STE buffer containing 0.15% Kathon as Biocide
Triathler Bench-top Scintillation counter   Hidex Oy, Turku, Finland Triathler LSC Model: 425-034  
Novex® TBE-Urea Sample Buffer (2×)   Invitrogen LC6876  
6% TBE-Urea Gels 1.0 mm, 10 wells   Invitrogen EC6865BOX  
Novex® TBE Running Buffer (5×)   Invitrogen LC6675  
Radioactivity decontaminant   Fisher Scientific 04-355-67  
Gel-loading tips   Denville Scientific P3080  
XCell SureLock Mini-Cell   Invitrogen EI0001 XCell SureLock Mini-Cell
Autoradiography film   Denville Scientific E3018 Use in complete darkness
Autoradiography film, Hyperfilm™ ECL   Amersham Biosciences RPN3114K Can be used under red safe light.
Membrane discs   Millipore GSWP02500 Mixed cellulose ester, hydrophilic, 0.22-μm disc membranes
Fritted glass support base for 125-ml flask   VWR 26316-696  
Petri dishes   Fisher Scientific 08-757-11YZ  
Urea   Fisher Scientific AC32738-0050  
EDTA   Fisher Scientific 118430010  
Glycogen   Sigma G1767  
2-Propanol for molecular biology   Sigma I9516  
Recombinant RNase inhibitor   USB Corporation 71571  
ImProm-II™Reverse Transcription System   Promega A3802  
Recombinant RNase inhibitor   USB Corporation 71571  
RapidRun™ Loading Dye   USB Corporation 77524  

References

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Cite This Article
Rahimi, F., Bitan, G. Selection of Aptamers for Amyloid β-Protein, the Causative Agent of Alzheimer's Disease. J. Vis. Exp. (39), e1955, doi:10.3791/1955 (2010).

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