Summary

アミロイドβ-蛋白質、アルツハイマー病の原因物質のためのアプタマーの選択

Published: May 13, 2010
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Summary

アプタマーは、で選択された短いribo-/deoxyribo-oligonucleotidesです<em>体外</em>特定のターゲットの親和性に基づく進化の方法。アプタマーは、多目的な治療、診断、および研究アプリケーションとの分子認識ツールです。我々は、アミロイドβ-蛋白質、アルツハイマー病の原因物質のためのアプタマーの選択のための方法を示しています。

Abstract

アルツハイマー病(AD)は1、その発症前診断が困難なレンダリング狡猾なコースを持つプログレッシブ、年齢依存性、神経変性疾患である。明確なADの診断は、このように、ADの発症前、早期診断が効果的な治療法2,3の開発と管理のための非常に重要である確立する、唯一の事後分析を実現しています。

アミロイドβ-蛋白質は(Aβ)ADの病因の中心です。水溶性、オリゴマーAβアセンブリはAD 4,5におけるシナプス機能障害とニューロンの損失の基礎となる神経毒性に影響を及ぼすと考えられている。可溶性Aβアセンブリの様々な形態が記載されている、しかし、それらの相互関係と、ADの病因および病因に関連性は複雑で、ウェル6理解されていない。症状が現れる前に、特定の分子認識ツールでは、Aβアセンブリ間の関係を解明し、疾患の過程で早期にこれらのアセンブリの検出と特徴付けを促進することができる。分子認識は、一般的に抗体に依存しています。しかし、分子認識ツールの代替クラス、アプタマーは、抗体7,8の相対重要な利点を提供しています。指数関数的濃縮(SELEX)9,10によるリガンドの系統進化:アプタマーは、 試験管内の選択によって生成されたオリゴヌクレオチドである。 SELEXは、ダーウィンの進化論に似て、可能にする、という反復的なプロセスであり、選択、増幅、濃縮、およびプロパティの永続化、など、熱心な、特定の、リガンド結合(アプタマー)または触媒活性(リボザイムとDNAzymes)。

現代のバイオテクノロジーと医学11のツールとしてのアプタマーの出現にもかかわらず、彼らはアミロイドの分野で十分に活用されています。いくつかのRNAまたはssDNAのアプタマーは、プリオン蛋白質(プリオン)12月16日の様々な形態に対して選択されています。組換えウシのPrPに対して生成されたRNAアプタマーは、アミロイド線維の18を形成する完全長のPrPの水溶性、オリゴマー、β-シートが豊富な立体配座の変異型、ウシのPrP -β17を認識することが示された。アプタマーは、線維のβ2 -ミクログロブリン(β2 m)の単量体といくつかの形式を使用して生成されたβ2メートルフィブリル19に加えて、特定の他のアミロイドタンパク質の線維を結合することが見出された。 Ylera 。固定化単量体のAβ4020に対して選択されたRNAアプタマーを説明した。不意に、これらのアプタマーは、線維Aβ40をバインド。完全に、これらのデータはいくつかの重要な問題を提起する。なぜ単量体のタンパク質に対して選択されたアプタマーは、それらのポリマー形態を認識するのですか?アミロイド生成性タンパク質の単量体及び/またはオリゴマーの形態に対するアプタマーが得られるか?これらの質問に対処するために、我々は、光誘起架橋無修正のタンパク質(PICUP)22,23を使用して生成された共有結合で安定化オリゴマーAβ4021のアプタマーを選択することを試みた。前回の調査結果17,19,20と同様に、これらのアプタマーは、おそらく構造aptatope 21潜在的に共通のアミロイドを認識Aβおよび他のいくつかのアミロイド蛋白質の線維と反応した。ここで、我々は、これらのアプタマー21の製造に使用されるSELEX方法論を提示する。

Protocol

パート1:蛋白質の調製と架橋当初は、SELEXに使用される蛋白質は、以前は23を説明するように、均質な、集約のない準備を取得するために1,1,1,3,3,3 -ヘキサフルオロ-2 -プロパノール(HFIP)で前処理されています。このステップは、事前に形成された凝集体は、貧しい人々の実験の再現性24で、その結果、アミロイド蛋白質の急速な凝集を誘導するために必要…

Discussion

SELEXプロセスの出発点は、通常、10 12 -10 15配列を含む、ランダムオリゴヌクレオチドライブラリーの合成です。 RNA SELEXで、ここに示したのに対し、DNA SELEXでは、このライブラリは、ssDNAのプールが生成された後に直接使用され、ssDNAのライブラリは、 インビトロ転写によって酵素的にRNAのプールに最初に変換されます。各サイクルが曝露と目的のターゲットへのオリゴ…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

この作品は、公衆衛生のカリフォルニア部からNIH / NIAと07から65798からの補助金AG030709によってサポートされていました。我々は、サポートおよび試薬を提供するためのペプチドの合成とアミノ酸分析のためのマーガレットM.コンドロン、プロジェクトの最初のステップを支援し、サポートするための博士エリザベスF.ニューフェルド、博士カイ香港B.チェンを認識し、博士とアンドリューD有用な議論のため。エリントン。

Materials

Material Name Type Company Catalogue Number Comment
Aβ40   UCLA Biopolymers Laboratory   Lyophilized powder
MX5 Automated-S Microbalance   Mettler Toledo    
Silicon-coated, 1.6-ml tubes   Denville Scientific C19033 or C19035  
1,1,1,3,3,3-hexafluoro-2-propanol (HFIP)   TCI America H0424 Use in a fume hood.
Ammonium persulfate   Sigma A-7460 Vortex until the solution is clear. APS is prepared freshly each time and should be used within 48 h.
Tris(2,2-bipridyl)dichlororuthenium(II) hexahydrate   Sigma 224758-1G Vortex until the solution is clear. Cover the RuBpy tube with foil to protect the reagent from ambient light. RuBpy is prepared freshly each time and should be used within 48 h.
Dithiothreitol (DTT)   Sigma 43815  
D-Salt™ Excellulose™ desalting columns   Thermo Scientific 20449  
Ammonium acetate   Fisher Scientific A637-500  
Silicon-coated, 0.6-ml tubes   Denville Scientific C19063  
Novex Tricine Gels (10–20%)   Invitrogen EC6625B0X 10-well; mini size (8 cm X 8 cm); 25 μl loading volume per well; separation range 5 kDa to 40 kDa
Quartz cuvette   Hellma 105.250-QS  
Beckman DU 640 spectrophotometer   Beckman    
ssDNA library   Integrated DNA Technologies Custom-ordered The library was designed to contain 49 random nucleotides flanked by two constant regions containing primer-binding and cloning sites: 5′-TAA TAC GAC TCA CTA TAG GGA ATT CCG CGT GTG C (N:25:25:25:25%) (N)49 G TCC GTT CGG GAT CCT C-3′
Taq DNA polymerase   USB Corporation 71160 Recombinant Thermus aquaticus DNA Polymerase supplied with 10× PCR Buffer and a separate tube of 25 mM MgCl2 for routine PCR.
PCR Nucleotide Mix, 10 mM solution   USB Corporation 77212 (10 mM each dATP, dCTP, dGTP, dTTP)
Forward primer   Integrated DNA Technologies Custom-ordered 5′-TAA TAC GAC TCA CTA TAG GGA ATT CCG CGT GTG C-3′
Reverse primer   Integrated DNA Technologies Custom-ordered 5′-GAG GAT CCC GAA CGG AC-3′
Thermal cycler   Denville Scientific Techne TC-312  
QIAquick PCR Purification Kit (50)   QIAGEN 28104  
Agarose   Denville Scientific CA3510-8  
Conical, sterile 1.6-ml tubes with caps attached with O-rings   Denville Scientific C19040-S  
RiboMAX™ Large Scale RNA Production System–T7   Promega P1300 The kit contains: 120 μl Enzyme Mix (RNA polymerase, recombinant RNasin® ribonuclease inhibitor and recombinant inorganic pyrophosphatase); 240 μl transcription 5 buffer; 100 μl each of 4 rNTPs, 100 mM; 110 U RQ1 RNase-free DNase, 1 U/μl; 10 μl linear control DNA, 1 mg/ml; 1 ml 3M sodium acetate (pH 5.2); 1.25 ml nuclease-Free water
α-32P-cytidine 5′-triphosphate, 250 μCi (9.25 MBq),   Perkin Elmer BLU008H250UC Specific Activity: 3000 Ci (111 TBq)/mmol, 50 mM Tricine (pH 7.6)
Citrate-saturated phenol:chloroform:isoamyl alcohol (125:24:1, pH 4.7)   Sigma (Fluka) 77619  
Chloroform:Isoamyl alcohol (24:1)   Sigma C0549  
Absolute ethanol for molecular biology   Sigma E7023  
Z216-MK refrigerated microcentrifuge   Denville Scientific C0216-MK  
illustra ProbeQuant™ G-50 Micro Columns   GE Healthcare Obtained from Fisher Scientific (45-001-487) Prepacked with Sephadex™ G-50 DNA Grade and pre-equilibrated in STE buffer containing 0.15% Kathon as Biocide
Triathler Bench-top Scintillation counter   Hidex Oy, Turku, Finland Triathler LSC Model: 425-034  
Novex® TBE-Urea Sample Buffer (2×)   Invitrogen LC6876  
6% TBE-Urea Gels 1.0 mm, 10 wells   Invitrogen EC6865BOX  
Novex® TBE Running Buffer (5×)   Invitrogen LC6675  
Radioactivity decontaminant   Fisher Scientific 04-355-67  
Gel-loading tips   Denville Scientific P3080  
XCell SureLock Mini-Cell   Invitrogen EI0001 XCell SureLock Mini-Cell
Autoradiography film   Denville Scientific E3018 Use in complete darkness
Autoradiography film, Hyperfilm™ ECL   Amersham Biosciences RPN3114K Can be used under red safe light.
Membrane discs   Millipore GSWP02500 Mixed cellulose ester, hydrophilic, 0.22-μm disc membranes
Fritted glass support base for 125-ml flask   VWR 26316-696  
Petri dishes   Fisher Scientific 08-757-11YZ  
Urea   Fisher Scientific AC32738-0050  
EDTA   Fisher Scientific 118430010  
Glycogen   Sigma G1767  
2-Propanol for molecular biology   Sigma I9516  
Recombinant RNase inhibitor   USB Corporation 71571  
ImProm-II™Reverse Transcription System   Promega A3802  
Recombinant RNase inhibitor   USB Corporation 71571  
RapidRun™ Loading Dye   USB Corporation 77524  

References

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Cite This Article
Rahimi, F., Bitan, G. Selection of Aptamers for Amyloid β-Protein, the Causative Agent of Alzheimer's Disease. J. Vis. Exp. (39), e1955, doi:10.3791/1955 (2010).

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