Summary

Selektion von Aptameren für Amyloid β-Protein, dem Erreger der Alzheimer-Krankheit

Published: May 13, 2010
doi:

Summary

Aptamere sind kurze ribo-/deoxyribo-oligonucleotides ausgewählt von<em> In-vitro</em> Evolution Methoden Affinität für ein bestimmtes Ziel basiert. Aptamere sind molekulare Erkennung Werkzeug mit vielfältigen therapeutische, diagnostische und Forschungszwecke entwickelt. Wir zeigen Methoden für die Selektion von Aptameren für Amyloid-β-Protein, dem Erreger der Alzheimer-Krankheit.

Abstract

Alzheimer-Krankheit (AD) ist eine progressive, altersabhängig, neurodegenerative Erkrankung mit einer schleichenden Verlauf, dass seine präsymptomatische Diagnose schwierig 1 macht. Definite AD Diagnose ist nur post mortem erreicht und schafft so präsymptomatischen, Früherkennung von AD ist entscheidend für die Entwicklung und Verwaltung von wirksamen Therapien 2,3.

Amyloid β-Protein (Aß) ist von zentraler Bedeutung AD Pathogenese. Lösliche, oligomere Aß Baugruppen sind vermutlich Neurotoxizität zugrunde liegende synaptische Dysfunktion und den Untergang der Neuronen in AD 4,5 beeinflussen. Verschiedene Formen von löslichem Aß Baugruppen beschrieben worden, jedoch sind ihre Zusammenhänge und die Relevanz für AD Ätiologie und Pathogenese komplexer und nicht gut verstanden 6. Spezifische molekulare Erkennung Tools können enträtseln die Beziehungen zwischen den Aß Baugruppen und erleichtern Nachweis und die Charakterisierung dieser Baugruppen frühzeitig im Krankheitsverlauf bevor Symptome auftauchen. Die molekulare Erkennung häufigsten beruht auf Antikörpern. Allerdings bietet eine alternative Klasse von molekularen Erkennung Werkzeuge, Aptamere, wichtige Vorteile gegenüber Antikörpern 7,8. Aptamere sind Oligonukleotide durch in-vitro-Selektion: systematische Evolution von Liganden durch exponentielle Anreicherung (SELEX) 9,10. SELEX ist ein iterativer Prozess, der, ähnlich wie die Darwinsche Evolution, ermöglicht die Auswahl, Verstärkung, Bereicherung und Perpetuierung einer Immobilie, zB Avid, spezifische Ligandenbindung (Aptamere) oder katalytische Aktivität (Ribozyme und DNAzyme).

Trotz Entstehung von Aptameren als Werkzeuge in der modernen Biotechnologie und Medizin 11, haben sie in den Amyloid-Bereich noch unzureichend genutzt. Wenige RNA oder ssDNA Aptamere gegen verschiedene Formen von Prion-Proteinen (PrP) 12-16 ausgewählt. Ein RNA-Aptamer gegen rekombinantes Rinder-PrP generiert wurde gezeigt, dass Rinder PrP-β 17 zu erkennen, einem löslichen, oligomeren β-Faltblatt-reiche Konformation Variante des full-length PrP, dass Amyloid-Fibrillen 18 bildet. Aptamere generiert mit monomeren und verschiedene Formen der fibrillären β 2-Mikroglobulin2 m) gefunden zu Fibrillen von bestimmten anderen amyloidogene Proteine ​​neben β 2 m Fibrillen 19 zu binden. Ylera et al. beschriebenen RNA-Aptamere gegen immobilisierte monomere Aβ40 20 ausgewählt. Unerwartet dieser Aptamere fibrillären Aβ40 gebunden. Insgesamt lassen diese Daten einige wichtige Fragen. Warum haben Aptamere gegen monomere Proteine ​​ausgewählt erkennen ihre polymeren Formen? Könnte Aptamere gegen monomere und / oder oligomere Formen amyloidogenen Proteinen erreicht werden? Zur Beantwortung dieser Fragen haben wir versucht, Aptamere für kovalent stabilisiert oligomeren Aβ40 21 erzeugt mit photo-induzierte Quervernetzung von unmodifizierten Proteine ​​(picup) 22,23 auszuwählen. Ähnlich wie in früheren Erkenntnisse 17,19,20, reagierte dieser Aptamere mit Fibrillen von Aß und mehrere andere amyloidogene Proteine ​​wahrscheinlich Erkennen einer potentiell gemeinsamen Amyloid strukturelle aptatope 21. Hier präsentieren wir die SELEX-Methode bei der Herstellung dieser Aptamere 21 verwendet.

Protocol

Teil 1: Protein Vorbereitung und Vernetzung Zunächst wird das Protein für SELEX verwendet mit 1,1,1,3,3,3-Hexafluor-2-propanol (HFIP) vorbehandelt, um eine homogene, Aggregat-freie Präparate, wie zuvor beschrieben 23 zu erhalten. Dieser Schritt ist notwendig, weil vorgeformte Aggregate induzieren schnelle Aggregation von Proteinen amyloidogene, was zu einer schlechten experimentelle Reproduzierbarkeit 24, und sind für die Selektion von Aptameren für aggregierte, nich…

Discussion

Der Ausgangspunkt des SELEX-Verfahrens ist die Synthese eines zufälligen Oligonukleotid-Bibliothek, die typischerweise 10 12 -10 15 Sequenzen. In DNA SELEX, diese Bibliothek direkt verwendet wird nach einer ssDNA-Pool generiert wird, während in RNA SELEX, hier demonstriert, ist die ssDNA-Bibliothek erst konvertiert, um ein RNA-Pool enzymatisch durch in-vitro-Transkription. Dann wird SELEX iterativ, wobei jeder Zyklus umfasst Belichtung und Bindung von Oligonukleotiden an das beabsichtigt…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Diese Arbeit wurde durch Zuschüsse AG030709 von NIH / NIA und 07-65798 vom California Department of Public Health unterstützt. Wir erkennen an, Margaret M. Condron für die Peptid-Synthese und Aminosäure-Analyse, Dr. Elizabeth F. Neufeld für die Hilfe und Unterstützung der ersten Schritte des Projekts, Dr. Chi-Hong Chen B. für die Bereitstellung von Unterstützung und Reagenzien und Dr. Andrew D . Ellington für hilfreiche Diskussionen.

Materials

Material Name Type Company Catalogue Number Comment
Aβ40   UCLA Biopolymers Laboratory   Lyophilized powder
MX5 Automated-S Microbalance   Mettler Toledo    
Silicon-coated, 1.6-ml tubes   Denville Scientific C19033 or C19035  
1,1,1,3,3,3-hexafluoro-2-propanol (HFIP)   TCI America H0424 Use in a fume hood.
Ammonium persulfate   Sigma A-7460 Vortex until the solution is clear. APS is prepared freshly each time and should be used within 48 h.
Tris(2,2-bipridyl)dichlororuthenium(II) hexahydrate   Sigma 224758-1G Vortex until the solution is clear. Cover the RuBpy tube with foil to protect the reagent from ambient light. RuBpy is prepared freshly each time and should be used within 48 h.
Dithiothreitol (DTT)   Sigma 43815  
D-Salt™ Excellulose™ desalting columns   Thermo Scientific 20449  
Ammonium acetate   Fisher Scientific A637-500  
Silicon-coated, 0.6-ml tubes   Denville Scientific C19063  
Novex Tricine Gels (10–20%)   Invitrogen EC6625B0X 10-well; mini size (8 cm X 8 cm); 25 μl loading volume per well; separation range 5 kDa to 40 kDa
Quartz cuvette   Hellma 105.250-QS  
Beckman DU 640 spectrophotometer   Beckman    
ssDNA library   Integrated DNA Technologies Custom-ordered The library was designed to contain 49 random nucleotides flanked by two constant regions containing primer-binding and cloning sites: 5′-TAA TAC GAC TCA CTA TAG GGA ATT CCG CGT GTG C (N:25:25:25:25%) (N)49 G TCC GTT CGG GAT CCT C-3′
Taq DNA polymerase   USB Corporation 71160 Recombinant Thermus aquaticus DNA Polymerase supplied with 10× PCR Buffer and a separate tube of 25 mM MgCl2 for routine PCR.
PCR Nucleotide Mix, 10 mM solution   USB Corporation 77212 (10 mM each dATP, dCTP, dGTP, dTTP)
Forward primer   Integrated DNA Technologies Custom-ordered 5′-TAA TAC GAC TCA CTA TAG GGA ATT CCG CGT GTG C-3′
Reverse primer   Integrated DNA Technologies Custom-ordered 5′-GAG GAT CCC GAA CGG AC-3′
Thermal cycler   Denville Scientific Techne TC-312  
QIAquick PCR Purification Kit (50)   QIAGEN 28104  
Agarose   Denville Scientific CA3510-8  
Conical, sterile 1.6-ml tubes with caps attached with O-rings   Denville Scientific C19040-S  
RiboMAX™ Large Scale RNA Production System–T7   Promega P1300 The kit contains: 120 μl Enzyme Mix (RNA polymerase, recombinant RNasin® ribonuclease inhibitor and recombinant inorganic pyrophosphatase); 240 μl transcription 5 buffer; 100 μl each of 4 rNTPs, 100 mM; 110 U RQ1 RNase-free DNase, 1 U/μl; 10 μl linear control DNA, 1 mg/ml; 1 ml 3M sodium acetate (pH 5.2); 1.25 ml nuclease-Free water
α-32P-cytidine 5′-triphosphate, 250 μCi (9.25 MBq),   Perkin Elmer BLU008H250UC Specific Activity: 3000 Ci (111 TBq)/mmol, 50 mM Tricine (pH 7.6)
Citrate-saturated phenol:chloroform:isoamyl alcohol (125:24:1, pH 4.7)   Sigma (Fluka) 77619  
Chloroform:Isoamyl alcohol (24:1)   Sigma C0549  
Absolute ethanol for molecular biology   Sigma E7023  
Z216-MK refrigerated microcentrifuge   Denville Scientific C0216-MK  
illustra ProbeQuant™ G-50 Micro Columns   GE Healthcare Obtained from Fisher Scientific (45-001-487) Prepacked with Sephadex™ G-50 DNA Grade and pre-equilibrated in STE buffer containing 0.15% Kathon as Biocide
Triathler Bench-top Scintillation counter   Hidex Oy, Turku, Finland Triathler LSC Model: 425-034  
Novex® TBE-Urea Sample Buffer (2×)   Invitrogen LC6876  
6% TBE-Urea Gels 1.0 mm, 10 wells   Invitrogen EC6865BOX  
Novex® TBE Running Buffer (5×)   Invitrogen LC6675  
Radioactivity decontaminant   Fisher Scientific 04-355-67  
Gel-loading tips   Denville Scientific P3080  
XCell SureLock Mini-Cell   Invitrogen EI0001 XCell SureLock Mini-Cell
Autoradiography film   Denville Scientific E3018 Use in complete darkness
Autoradiography film, Hyperfilm™ ECL   Amersham Biosciences RPN3114K Can be used under red safe light.
Membrane discs   Millipore GSWP02500 Mixed cellulose ester, hydrophilic, 0.22-μm disc membranes
Fritted glass support base for 125-ml flask   VWR 26316-696  
Petri dishes   Fisher Scientific 08-757-11YZ  
Urea   Fisher Scientific AC32738-0050  
EDTA   Fisher Scientific 118430010  
Glycogen   Sigma G1767  
2-Propanol for molecular biology   Sigma I9516  
Recombinant RNase inhibitor   USB Corporation 71571  
ImProm-II™Reverse Transcription System   Promega A3802  
Recombinant RNase inhibitor   USB Corporation 71571  
RapidRun™ Loading Dye   USB Corporation 77524  

References

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Cite This Article
Rahimi, F., Bitan, G. Selection of Aptamers for Amyloid β-Protein, the Causative Agent of Alzheimer's Disease. J. Vis. Exp. (39), e1955, doi:10.3791/1955 (2010).

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