Selezione di Aptamers per β-amiloide proteina, l'agente eziologico della malattia di Alzheimer
Summary
Aptameri sono ribo-/deoxyribo-oligonucleotides corti selezionati<em> In vitro</em> Metodi evoluzione sulla base di affinità per un target specifico. Aptameri sono strumenti di riconoscimento molecolare con versatili applicazioni terapeutiche, diagnostiche e di ricerca. Dimostriamo metodi per la selezione di aptameri per la β-amiloide, proteina, l'agente eziologico della malattia di Alzheimer.
Abstract
Malattia di Alzheimer (AD) è un progressista, età-dipendente, malattia neurodegenerativa con un corso insidioso che rende difficile la diagnosi presintomatica 1. DC diagnosi definitiva si ottiene solo post-mortem, stabilendo così presintomatica, diagnosi precoce di Alzheimer è cruciale per lo sviluppo e l'amministrazione terapie efficaci 2,3.
Proteina β-amiloide (Aβ) è fondamentale per la patogenesi dell'Alzheimer. Solubile, le assemblee oligomeriche Aβ si ritiene di influenzare neurotossicità sottostante disfunzione sinaptica e perdita di neuroni in AD 4,5. Varie forme di Aβ solubile assemblee sono stati descritti, tuttavia, le loro interrelazioni e la pertinenza ad eziologia e la patogenesi dC sono complessi e non ben compreso 6. Specifici strumenti di riconoscimento molecolare può svelare i rapporti tra assemblee Aβ e facilitare l'individuazione e caratterizzazione di queste assemblee nelle prime fasi del decorso della malattia prima che i sintomi emergere. Il riconoscimento molecolare si basa generalmente su anticorpi. Tuttavia, una classe alternativa di strumenti di riconoscimento molecolare, aptameri, offre importanti vantaggi rispetto agli anticorpi 7,8. Aptameri oligonucleotidi sono generate da in-vitro selezione: evoluzione sistematica dei ligandi di arricchimento esponenziale (SELEX) 9,10. SELEX è un processo iterativo che, simile a quello dell'evoluzione darwiniana, permette la selezione, l'amplificazione, l'arricchimento, e la perpetuazione di una proprietà, ad esempio, avido, specifico, di legame (aptameri) o l'attività catalitica (ribozimi e DNAzymes).
Nonostante la comparsa di aptameri come strumenti nel campo della biotecnologia moderna e della medicina 11, sono stati sottoutilizzati nel campo amiloide. RNA pochi o aptameri ssDNA sono stati selezionati contro varie forme di proteine prioniche (PrP) 12-16. Un aptamero RNA generati contro ricombinante PrP bovina ha dimostrato di riconoscere bovina PrP-β 17, una solubile, oligomerici, β-sheet ricco di variante conformazionale di full-length PrP che si forma fibrille amiloidi 18. Aptameri generati utilizzando forme monomeriche e molti dei β fibrillare sono stati trovati 2-microglobulina (β 2 m) per legare fibrille di alcune altre proteine amiloidogenica β oltre 2 m fibrille 19. Ylera et al. descritto aptameri RNA selezionato contro immobilizzato monomerico Aβ40 20. Inaspettatamente, queste aptameri legato fibrillare Aβ40. Complessivamente, questi dati sollevano diverse questioni importanti. Perché aptameri selezionati contro proteine monomeriche riconoscere loro forme polimeriche? Potrebbe aptameri contro le forme monomerica e / o oligomerici di proteine amiloidogenica ottenere? Per rispondere a queste domande, abbiamo cercato di selezionare aptameri per covalentemente stabilizzato oligomerici Aβ40 21 generati utilizzando foto-indotta cross-linking delle proteine non modificato (PICUP) 22,23. Simile a risultati precedenti 17,19,20, questi aptameri reagito con fibrille di altre proteine Aβ e diversi amiloidogenico probabilmente riconoscere un amiloide potenzialmente comuni strutturali aptatope 21. Qui, vi presentiamo la metodologia SELEX utilizzati nella produzione di questi aptameri 21.
Protocol
Discussion
Il punto di partenza del processo di SELEX è sintesi di una libreria oligonucleotide casuale tipicamente contiene 10 12 -10 15 sequenze. Nel DNA SELEX, questa libreria è utilizzata direttamente dopo un pool di ssDNA viene generato, mentre in RNA SELEX, dimostrato qui, la biblioteca ssDNA viene convertito prima a un pool di RNA enzimaticamente da trascrizione in vitro. Poi, SELEX viene eseguito iterativamente per cui ogni ciclo comprende l'esposizione e vincolante di oligonucleotidi p…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo lavoro è stato sostenuto dalle concessioni AG030709 dal NIH / NIA e 07-65798 del California Department of Public Health. Riconosciamo Margaret M. Condron per la sintesi di peptidi e analisi degli aminoacidi, la dottoressa Elizabeth F. Neufeld per aiutare e sostenere i passi iniziali del progetto, il Dr. B. Chi-Hong Chen di sostegno e di reagenti e Dr. Andrew D . Ellington per le discussioni utili.
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Aβ40 | UCLA Biopolymers Laboratory | Lyophilized powder | ||
| MX5 Automated-S Microbalance | Mettler Toledo | |||
| Silicon-coated, 1.6-ml tubes | Denville Scientific | C19033 or C19035 | ||
| 1,1,1,3,3,3-hexafluoro-2-propanol (HFIP) | TCI America | H0424 | Use in a fume hood. | |
| Ammonium persulfate | Sigma | A-7460 | Vortex until the solution is clear. APS is prepared freshly each time and should be used within 48 h. | |
| Tris(2,2-bipridyl)dichlororuthenium(II) hexahydrate | Sigma | 224758-1G | Vortex until the solution is clear. Cover the RuBpy tube with foil to protect the reagent from ambient light. RuBpy is prepared freshly each time and should be used within 48 h. | |
| Dithiothreitol (DTT) | Sigma | 43815 | ||
| D-Salt™ Excellulose™ desalting columns | Thermo Scientific | 20449 | ||
| Ammonium acetate | Fisher Scientific | A637-500 | ||
| Silicon-coated, 0.6-ml tubes | Denville Scientific | C19063 | ||
| Novex Tricine Gels (10–20%) | Invitrogen | EC6625B0X | 10-well; mini size (8 cm X 8 cm); 25 μl loading volume per well; separation range 5 kDa to 40 kDa | |
| Quartz cuvette | Hellma | 105.250-QS | ||
| Beckman DU 640 spectrophotometer | Beckman | |||
| ssDNA library | Integrated DNA Technologies | Custom-ordered | The library was designed to contain 49 random nucleotides flanked by two constant regions containing primer-binding and cloning sites: 5′-TAA TAC GAC TCA CTA TAG GGA ATT CCG CGT GTG C (N:25:25:25:25%) (N)49 G TCC GTT CGG GAT CCT C-3′ | |
| Taq DNA polymerase | USB Corporation | 71160 | Recombinant Thermus aquaticus DNA Polymerase supplied with 10× PCR Buffer and a separate tube of 25 mM MgCl2 for routine PCR. | |
| PCR Nucleotide Mix, 10 mM solution | USB Corporation | 77212 | (10 mM each dATP, dCTP, dGTP, dTTP) | |
| Forward primer | Integrated DNA Technologies | Custom-ordered | 5′-TAA TAC GAC TCA CTA TAG GGA ATT CCG CGT GTG C-3′ | |
| Reverse primer | Integrated DNA Technologies | Custom-ordered | 5′-GAG GAT CCC GAA CGG AC-3′ | |
| Thermal cycler | Denville Scientific | Techne TC-312 | ||
| QIAquick PCR Purification Kit (50) | QIAGEN | 28104 | ||
| Agarose | Denville Scientific | CA3510-8 | ||
| Conical, sterile 1.6-ml tubes with caps attached with O-rings | Denville Scientific | C19040-S | ||
| RiboMAX™ Large Scale RNA Production System–T7 | Promega | P1300 | The kit contains: 120 μl Enzyme Mix (RNA polymerase, recombinant RNasin® ribonuclease inhibitor and recombinant inorganic pyrophosphatase); 240 μl transcription 5 buffer; 100 μl each of 4 rNTPs, 100 mM; 110 U RQ1 RNase-free DNase, 1 U/μl; 10 μl linear control DNA, 1 mg/ml; 1 ml 3M sodium acetate (pH 5.2); 1.25 ml nuclease-Free water | |
| α-32P-cytidine 5′-triphosphate, 250 μCi (9.25 MBq), | Perkin Elmer | BLU008H250UC | Specific Activity: 3000 Ci (111 TBq)/mmol, 50 mM Tricine (pH 7.6) | |
| Citrate-saturated phenol:chloroform:isoamyl alcohol (125:24:1, pH 4.7) | Sigma (Fluka) | 77619 | ||
| Chloroform:Isoamyl alcohol (24:1) | Sigma | C0549 | ||
| Absolute ethanol for molecular biology | Sigma | E7023 | ||
| Z216-MK refrigerated microcentrifuge | Denville Scientific | C0216-MK | ||
| illustra ProbeQuant™ G-50 Micro Columns | GE Healthcare | Obtained from Fisher Scientific (45-001-487) | Prepacked with Sephadex™ G-50 DNA Grade and pre-equilibrated in STE buffer containing 0.15% Kathon as Biocide | |
| Triathler Bench-top Scintillation counter | Hidex Oy, Turku, Finland | Triathler LSC Model: 425-034 | ||
| Novex® TBE-Urea Sample Buffer (2×) | Invitrogen | LC6876 | ||
| 6% TBE-Urea Gels 1.0 mm, 10 wells | Invitrogen | EC6865BOX | ||
| Novex® TBE Running Buffer (5×) | Invitrogen | LC6675 | ||
| Radioactivity decontaminant | Fisher Scientific | 04-355-67 | ||
| Gel-loading tips | Denville Scientific | P3080 | ||
| XCell SureLock Mini-Cell | Invitrogen | EI0001 | XCell SureLock Mini-Cell | |
| Autoradiography film | Denville Scientific | E3018 | Use in complete darkness | |
| Autoradiography film, Hyperfilm™ ECL | Amersham Biosciences | RPN3114K | Can be used under red safe light. | |
| Membrane discs | Millipore | GSWP02500 | Mixed cellulose ester, hydrophilic, 0.22-μm disc membranes | |
| Fritted glass support base for 125-ml flask | VWR | 26316-696 | ||
| Petri dishes | Fisher Scientific | 08-757-11YZ | ||
| Urea | Fisher Scientific | AC32738-0050 | ||
| EDTA | Fisher Scientific | 118430010 | ||
| Glycogen | Sigma | G1767 | ||
| 2-Propanol for molecular biology | Sigma | I9516 | ||
| Recombinant RNase inhibitor | USB Corporation | 71571 | ||
| ImProm-II™Reverse Transcription System | Promega | A3802 | ||
| Recombinant RNase inhibitor | USB Corporation | 71571 | ||
| RapidRun™ Loading Dye | USB Corporation | 77524 |
References
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