このプロトコルはパーキンソン病のアルファ シヌクレインによって基づくショウ ジョウバエ モデルの模倣の便秘のための試金を示す。
パーキンソン病(PD)の非運動症状は一般的で、治療が困難であり、生活の質を著しく損ないます。一般的な非運動症状の1つは便秘であり、PDの診断に数年または数十年先行することがあります。便秘はPDの動物モデルでは十分に調査されておらず、特定の治療法がありません。このアッセイは、ヒトα-シヌクレインが汎ニューロンドライバーの下で発現するPDの ショウジョウバエ モデルを利用しています。α-シヌクレインを発現するハエは、ドーパミン作動性ニューロンの喪失、運動障害、α-シヌクレイン封入体など、PDの特徴を発現します。
このプロトコルはこれらのはえの便秘を調査するための方法を概説する。ハエは、青色の着色料を添加したハエの餌に一晩置き、翌日に標準食に移します。その後、標準的なハエの餌が入った新しいバイアルに8時間毎時移されます。各移送の前に、バイアル壁の糞便斑点の合計に対する青色の糞便斑点の割合が計算されます。α-シヌクレインを欠損した対照ハエは、α-シヌクレインを発現するハエの数時間前にすべての青色色素を排出します。さらに、腸からの青い色の食べ物の通過は、簡単な写真で監視できます。このアッセイの簡便さは、 ショウジョウバエの便秘の修飾因子を特定するための前方遺伝学的または化学的スクリーニングでの使用を可能にします。
パーキンソン病(PD)は進行性の神経変性疾患であり、運動緩慢、硬直、振戦などの運動症状の存在を臨床的に特徴とし、重大な罹患率をもたらします1。病理学的には、PDは黒質におけるドーパミン作動性ニューロンの喪失およびα-シヌクレインのミスフォールディングによって定義され、レビー小体およびレビー神経突起の形成につながる。パーキンソン病の病因は未だによくわかっておらず、遺伝的要因と環境的要因の複雑な相互作用に起因している可能性が高い2,3。現在、疾患修飾療法は利用できませんが、これはおそらく診断時に存在する病理学の進行した段階が一因です。研究によると、黒質のドーパミン作動性ニューロンの60%以上が運動症状の発症によってすでに失われており、疾患の早期発見のための潜在的なバイオマーカーを探る必要性が強調されています4。そのような臨床バイオマーカーの1つが便秘であり、これはPD患者によく見られ5,6、運動症状の発症に数年または数十年先行する可能性があります。
運動症状に基づくPDの臨床的定義にもかかわらず、便秘はいくつかの非運動症状の1つであり、対症療法の治療がより困難であり、患者の生活の質に重大な障害を引き起こします7。脳と腸神経系の間の双方向のコミュニケーションを表す腸脳軸の変化は、PDの病因に関与しています。α-シヌクレイン凝集体はPD患者の消化管からの組織サンプル中に見出されており8、動物モデルでは、腸神経系のα-シヌクレイン凝集体がプリオン様に中枢神経系に広がることが示唆されている9。さらに、PD患者は腸内細菌叢に異常を示し10、過度の腸内炎症を経験する可能性がある11。PDの便秘は十分に研究されておらず、ハエ12,13またはげっ歯類14,15におけるパーキンソン病関連便秘のモデルはほとんど報告されていません。
このアッセイは、ハエが汎ニューロンドライバーであるn-シナプトブレビンの制御下でヒトα-シヌクレイン遺伝子を発現するPDのショウジョウバエモデルを採用しています。これらのハエは、α-シヌクレイン凝集、運動機能障害、加齢に伴う神経変性など、PDのすべての特徴的な特徴を示し、ドーパミン作動性ニューロンの喪失をもたらします16,17。以前の研究では、腸機能障害を評価するためにハエの糞便量を測定し、ハエの糞便を定量化し、さまざまな遺伝子系統の排泄物量を比較して、消化器系の機能的な違いを明らかにしました18,19,20。ここでは、ヒトα-シヌクレインを発現するハエを用いた便秘アッセイを実証します。このシンプルでありながら貴重なツールは、PDの重要な非運動症状の研究を可能にします。
このプロトコルには、アッセイを成功裏に完了させるのに役立ついくつかのステップがあります。まず、各バイアルの各ラウンド間の時間間隔が実験全体を通して一貫していることを確認することが重要です。バイアルに番号をラベル付けすると、長い遺伝子型の説明が不要になり、時間を節約できます。さらに、糞便22 を数える方法は、実験全体を通して一貫していることが重要です。食品やバイアルのプラグには青い糞便が見えますが、無色の糞便は見えません。したがって、食品またはバイアルプラグの青い点を数えないでください。
行動アッセイでは、ハエの行動の変動やアッセイに影響を与える未知の変数により、結果に一貫性がなくなる可能性が常にあります。すべての実験に、同じショウ ジョウバエ 培地、同じ食用色素、同じブランドのバイアルを使用することをお勧めします。興味深いことに、いくつかの試験では、ハエの概日リズムが原因で、ハエは午後の早い時間に排便する頻度が低くなる傾向があることが観察されました23。しかし、この行動は対照のハエとα-シヌクレインを発現するハエの両方で一貫しているため、懸念はありません。
アッセイの開始時にハエが青色の糞便を排泄しない場合は、使用されている染料が十分に色素化されていない可能性があります。この場合、それに応じて蒸留水に対する染料の比率を増やすことができます。また、ハエの消化管に青い餌が少量しか残っていない場合、糞便が淡い青色か無色かを判断するのが難しい場合もあります。これが発生した場合は、バイアルの後ろに白い紙を置くと、糞便ドットの色を決定するのに役立ちます。糞便が非常に水色であっても、無色の糞便ではなく青色の糞便として記録するのが最善です。
このアッセイの限界の1つは、糞便の斑点を手作業で数える必要があることです。ハイスループットスクリーニングの可能性を高めるために、このプロトコルは将来、マルチウェルプレート内の個々のハエによって生成される青色の糞便スポットの自動定量を可能にするように変更される可能性があります。もう一つの限界は、α-シヌクレインモデルがPDの前駆体モデルに発展する可能性を秘めているが、神経変性を伴わずに便秘が存在する最適な時点がまだ特定されていないことである。
要約すると、この方法は、PDの ショウジョウバエ モデルで、研究が進んでいない非運動性PD症状である便秘をモデル化するためのシンプルで簡単なアプローチを提供します。
The authors have nothing to disclose.
ブリガム・アンド・ウィメンズ病院とハーバード大学医学部のメル・フィーニー博士には、ショウ ジョウバエ 系統を発現する対照とα-シヌクレインの親切な贈り物に感謝します。オルセン博士への助成金は、NINDS K08、米国パーキンソン病協会ジョージ・C・コッツィアス・フェローシップ、国防総省パーキンソン病早期研究者賞です。
1400 g sucrose | MP Biomedicals | 904713 | |
1800 g dextrose | MP Biomedicals | 901521 | |
2884 g yeast | MP Biomedicals | 903312 | |
428 g agar | Fisher Scientific | 10253156 | |
4600 mL molasses | Grandma's Molasses | 7971942 | |
68 L water | N/A | N/A | |
680 mL tegosept mix (1200 g tegosept in 6 L ethanol) | |||
6864 g cornmeal | Pearl Milling | 125045 | |
800 mL acid mix (83 mL phosphoric acid in 1 L water + 836 mL propionic acid in 1 L water) | |||
cellSens Standard software | Olympus | N/A | |
Ethanol | Pharmco-Aper | 111ACS200 | |
Flugs for wide plastic vials | Genesee Scientific | 49-101 | |
Flystuff wide Drosophila vials, polystyrene | Genesee Scientific | 32-117 | |
Graphpad Prism | GraphPad | N/A | Version 9.5.1 |
Olympus DP23 camera | Olympus | N/A | |
Olympus SZX12 Stereo Microscope | Olympus | N/A | |
Phosphoric Acid | Fisher Scientific | S25470A | |
Propionic Acid | Fisher Scientific | A258 – 500 | |
Soft gel paste food color, Royal blue | AmeriColor | 202 | |
Tegosept | Apex | 20-258 | |
Drosophila Stocks | |||
nSyb-QF2, nSyb-Gal4 | All lines provided by Dr. Mel Feany | N/A | Lines are available directly from Dr. Feany |
nSyb-QF2, nSyb-Gal4, QUAS-alpha synuclein | N/A | ||
w1118 | N/A |