Questo protocollo presenta un test per la modellazione della stitichezza in un modello di Drosophila basato sull’alfa-sinucleina del morbo di Parkinson.
I sintomi non motori nella malattia di Parkinson (PD) sono comuni, difficili da trattare e compromettono significativamente la qualità della vita. Un sintomo non motorio prevalente è la stitichezza, che può precedere la diagnosi di malattia di Parkinson di anni o addirittura decenni. La stitichezza è stata poco esplorata nei modelli animali di Parkinson e manca di terapie specifiche. Questo test utilizza un modello di Drosophila di PD in cui l’alfa-sinucleina umana è espressa sotto un driver pan-neuronale. I moscerini che esprimono alfa-sinucleina sviluppano le caratteristiche distintive del morbo di Parkinson: la perdita di neuroni dopaminergici, la compromissione motoria e le inclusioni di alfa-sinucleina.
Questo protocollo delinea un metodo per studiare la stitichezza in questi moscerini. Le mosche vengono posizionate sul cibo per mosche con un additivo di colore blu durante la notte e poi trasferite al cibo standard il giorno successivo. Successivamente vengono spostati in nuove fiale con cibo standard per mosche ogni ora per 8 ore. Prima di ogni trasferimento, viene calcolata la percentuale di macchie fecali di colore blu rispetto alle macchie fecali totali sulla parete del flaconcino. I moscerini di controllo privi di alfa-sinucleina espellono tutto il colorante blu ore prima che i moscerini esprimano l’alfa-sinucleina. Inoltre, il passaggio di cibo di colore blu dall’intestino può essere monitorato con una semplice fotografia. La semplicità di questo test ne consente l’uso in screening genetici o chimici per identificare i modificatori della stitichezza in Drosophila.
La malattia di Parkinson (PD) è una malattia neurodegenerativa progressiva caratterizzata clinicamente dalla presenza di sintomi motori come bradicinesia, rigidità e tremore, con conseguente significativa morbilità1. Dal punto di vista patologico, la malattia di Parkinson è definita dalla perdita di neuroni dopaminergici nella substantia nigra e dal misfolding dell’alfa-sinucleina, che porta alla formazione di corpi di Lewy e neuriti di Lewy. La patogenesi della malattia di Parkinson rimane poco conosciuta, probabilmente a causa di una complessa interazione di fattori genetici e ambientali 2,3. Attualmente, le terapie modificanti la malattia non sono disponibili, probabilmente in parte a causa dello stadio avanzato della patologia presente al momento della diagnosi. Gli studi hanno dimostrato che oltre il 60% dei neuroni dopaminergici nella substantia nigra sono già stati persi dall’insorgenza dei sintomi motori, sottolineando la necessità di esplorare potenziali biomarcatori per la diagnosi precoce della malattia4. Uno di questi biomarcatori clinici è la stitichezza, che è comune nei pazienti con PD 5,6 e può precedere l’insorgenza dei sintomi motori di anni o addirittura decenni.
Nonostante la definizione clinica del PD si basi sui sintomi motori, la stitichezza è uno dei numerosi sintomi non motori che sono più difficili da trattare sintomaticamente e causano una significativa compromissione della qualità della vita dei pazienti7. Le alterazioni dell’asse intestino-cervello, che rappresenta la comunicazione bidirezionale tra il cervello e il sistema nervoso enterico, sono state implicate nella patogenesi del morbo di Parkinson. Aggregati di alfa-sinucleina sono stati trovati in campioni di tessuto provenienti dal tratto gastrointestinale di pazienti con PD8 e modelli animali suggeriscono che gli aggregati di alfa-sinucleina nel sistema nervoso enterico si diffondono in modo simile ai prioni al sistema nervoso centrale9. Inoltre, i pazienti affetti da Parkinson presentano anomalie nel microbioma intestinale10 e possono manifestare un’eccessiva infiammazione intestinale11. La stitichezza nel morbo di Parkinson è stata poco studiata, con pochi modelli riportati di stipsi associata al Parkinson nei moscerini 12,13 o nei roditori14,15.
Questo test impiega un modello di Drosophila di PD in cui i moscerini esprimono il gene dell’alfa-sinucleina umana sotto il controllo di un driver pan-neuronale, la n-sinaptobrevina. Questi moscerini presentano tutte le caratteristiche distintive del morbo di Parkinson, tra cui l’aggregazione di alfa-sinucleina, la disfunzione motoria e la neurodegenerazione legata all’età, con conseguente perdita di neuroni dopaminergici16,17. Studi precedenti hanno introdotto la misurazione della produzione fecale nei moscerini per valutare la disfunzione intestinale, quantificando la materia fecale dei moscerini e confrontando le quantità di escrementi tra varie linee genetiche per rivelare differenze funzionali nel sistema digestivo 18,19,20. Qui, dimostriamo il test di stitichezza utilizzando mosche che esprimono alfa-sinucleina umana. Questo semplice ma prezioso strumento consente lo studio di un importante sintomo non motorio del morbo di Parkinson.
Ci sono diversi passaggi in questo protocollo che aiuteranno a completare con successo il test. In primo luogo, è importante assicurarsi che gli intervalli di tempo tra ogni ciclo per ogni flaconcino siano coerenti durante l’esperimento. Etichettare le fiale con i numeri aiuterà a evitare la necessità di lunghe descrizioni del genotipo, risparmiando tempo. Inoltre, è fondamentale che il metodo per contare la materia fecale22 rimanga coerente per tutta la durata dell’esperimento. Mentre la materia fecale blu è visibile sul cibo e sul tappo del flaconcino, la materia fecale incolore non lo è. Pertanto, non contare i punti blu sul tappo del cibo o del flaconcino.
Con i saggi comportamentali, c’è sempre la possibilità di incongruenze nei risultati a causa di fluttuazioni nel comportamento dei moscerini o di variabili sconosciute che influenzano il saggio. Si consiglia di utilizzare lo stesso terreno di Drosophila , lo stesso colorante alimentare e la stessa marca di fiale per tutti gli esperimenti. È interessante notare che, in diversi studi, è stato osservato che le mosche tendono a defecare meno frequentemente nel primo pomeriggio, probabilmente a causa del ritmo circadianodelle mosche 23. Tuttavia, questo comportamento è coerente sia nei moscerini di controllo che nei moscerini che esprimono alfa-sinucleina, quindi non dovrebbe destare preoccupazioni.
Se le mosche non espellono materia fecale blu all’inizio del test, è possibile che il colorante utilizzato non sia abbastanza pigmentato. In questo caso, si può aumentare di conseguenza il rapporto tra colorante e acqua distillata. È anche possibile che quando rimane solo una piccola quantità di cibo blu nel tratto digestivo della mosca, possa essere difficile determinare se la materia fecale è blu pallido o incolore. Quando ciò si verifica, posizionare un foglio di carta bianca dietro la fiala aiuterà a determinare il colore del punto fecale. Anche se la materia fecale è molto azzurra, è meglio registrarla come materia fecale blu piuttosto che come materia fecale incolore.
Un limite di questo test è che richiede il conteggio manuale delle macchie fecali. Per migliorare il potenziale di screening ad alto rendimento, questo protocollo potrebbe essere modificato in futuro per consentire la quantificazione automatizzata delle macchie fecali blu prodotte da singoli moscerini in piastre multi-pozzetto. Un’altra limitazione è che, sebbene il modello di alfa-sinucleina abbia il potenziale per essere sviluppato in un modello prodromico di PD, non è stato ancora identificato un punto temporale ottimale in cui la stitichezza è presente senza neurodegenerazione.
In sintesi, questo metodo offre un approccio semplice e diretto alla modellazione della stitichezza, un sintomo non motorio della malattia di Parkinson poco studiato, in un modello di malattia di Parkinson di Drosophila .
The authors have nothing to disclose.
Ringraziamo il Dr. Mel Feany del Brigham and Women’s Hospital e della Harvard Medical School per il gentile dono delle linee di controllo e dell’alfa-sinucleina che esprime Drosophila . Riconosciamo le seguenti fonti di sovvenzione al Dr. Olsen: NINDS K08, American Parkinson Disease Association George C. Cotzias Fellowship, Department of Defense Parkinson’s Disease Early Investigator Award.
1400 g sucrose | MP Biomedicals | 904713 | |
1800 g dextrose | MP Biomedicals | 901521 | |
2884 g yeast | MP Biomedicals | 903312 | |
428 g agar | Fisher Scientific | 10253156 | |
4600 mL molasses | Grandma's Molasses | 7971942 | |
68 L water | N/A | N/A | |
680 mL tegosept mix (1200 g tegosept in 6 L ethanol) | |||
6864 g cornmeal | Pearl Milling | 125045 | |
800 mL acid mix (83 mL phosphoric acid in 1 L water + 836 mL propionic acid in 1 L water) | |||
cellSens Standard software | Olympus | N/A | |
Ethanol | Pharmco-Aper | 111ACS200 | |
Flugs for wide plastic vials | Genesee Scientific | 49-101 | |
Flystuff wide Drosophila vials, polystyrene | Genesee Scientific | 32-117 | |
Graphpad Prism | GraphPad | N/A | Version 9.5.1 |
Olympus DP23 camera | Olympus | N/A | |
Olympus SZX12 Stereo Microscope | Olympus | N/A | |
Phosphoric Acid | Fisher Scientific | S25470A | |
Propionic Acid | Fisher Scientific | A258 – 500 | |
Soft gel paste food color, Royal blue | AmeriColor | 202 | |
Tegosept | Apex | 20-258 | |
Drosophila Stocks | |||
nSyb-QF2, nSyb-Gal4 | All lines provided by Dr. Mel Feany | N/A | Lines are available directly from Dr. Feany |
nSyb-QF2, nSyb-Gal4, QUAS-alpha synuclein | N/A | ||
w1118 | N/A |