Dit protocol presenteert een test voor het modelleren van constipatie in een op alfa-synucleïne gebaseerd Drosophila-model van de ziekte van Parkinson.
Niet-motorische symptomen bij de ziekte van Parkinson (PD) komen vaak voor, zijn moeilijk te behandelen en tasten de kwaliteit van leven aanzienlijk aan. Een veel voorkomend niet-motorisch symptoom is constipatie, die jaren of zelfs decennia aan de diagnose PD kan voorafgaan. Constipatie is onderbelicht in diermodellen van PD en mist specifieke therapieën. Deze test maakt gebruik van een Drosophila-model van PD waarin humaan alfa-synucleïne tot expressie wordt gebracht onder een pan-neuronale driver. Vliegen die alfa-synucleïne tot expressie brengen, ontwikkelen de kenmerkende kenmerken van PD: het verlies van dopaminerge neuronen, motorische stoornissen en alfa-synucleïne-insluitsels.
Dit protocol schetst een methode voor het bestuderen van constipatie bij deze vliegen. Vliegen worden ‘s nachts op vliegvoer met een blauwe kleuradditief geplaatst en de volgende dag overgebracht naar standaardvoer. Vervolgens worden ze gedurende 8 uur elk uur verplaatst naar nieuwe flacons met standaard vliegenvoer. Vóór elke overdracht wordt het percentage blauwgekleurde fecale vlekken ten opzichte van het totale aantal fecale vlekken op de wand van de injectieflacon berekend. Controlevliegen die geen alfa-synucleïne hebben, verdrijven alle blauwe kleurstof uren voordat vliegen alfa-synucleïne tot expressie brengen. Bovendien kan de doorgang van blauwgekleurd voedsel uit de darm worden gevolgd met eenvoudige fotografie. De eenvoud van deze test maakt het mogelijk om het te gebruiken in voorwaartse genetische of chemische screenings om modificatoren van constipatie in Drosophila te identificeren.
De ziekte van Parkinson (PD) is een progressieve neurodegeneratieve aandoening die klinisch wordt gekenmerkt door de aanwezigheid van motorische symptomen zoals bradykinesie, stijfheid en tremor, resulterend in significante morbiditeit1. Pathologisch wordt PD gedefinieerd door het verlies van dopaminerge neuronen in de substantia nigra en het verkeerd vouwen van alfa-synucleïne, wat leidt tot de vorming van Lewy-lichaampjes en Lewy-neurieten. De pathogenese van PD blijft slecht begrepen en is waarschijnlijk het gevolg van een complex samenspel van genetische en omgevingsfactoren 2,3. Momenteel zijn ziektemodificerende therapieën niet beschikbaar, mogelijk deels als gevolg van het vergevorderde stadium van pathologie dat aanwezig is op het moment van diagnose. Studies hebben aangetoond dat meer dan 60% van de dopaminerge neuronen in de substantia nigra al verloren zijn gegaan door het begin van motorische symptomen, wat de noodzaak onderstreept om potentiële biomarkers voor vroege detectie van ziekten te onderzoeken. Een van die klinische biomarkers is constipatie, die vaak voorkomt bij PD-patiënten 5,6 en jaren of zelfs decennia kan voorafgaan aan het begin van motorische symptomen.
Ondanks de klinische definitie van PD op basis van motorische symptomen, is constipatie een van de vele niet-motorische symptomen die symptomatisch moeilijker te behandelen zijn en een aanzienlijke verslechtering van de kwaliteitvan leven van patiënten veroorzaken. Veranderingen in de darm-hersenas, die bidirectionele communicatie tussen de hersenen en het enterische zenuwstelsel vertegenwoordigt, zijn betrokken bij de pathogenese van PD. Alfa-synucleïne-aggregaten zijn gevonden in weefselmonsters uit het maagdarmkanaal van PD-patiënten8, en diermodellen suggereren dat alfa-synucleïne-aggregaten in het enterische zenuwstelsel zich op een prionachtige manier verspreiden naar het centrale zenuwstelsel9. Bovendien vertonen PD-patiënten afwijkingen in het darmmicrobioom10 en kunnen ze overmatige darmontsteking ervaren11. Constipatie bij PD is onderbelicht, met weinig gerapporteerde modellen van Parkinson-geassocieerde constipatie bij vliegen12,13 of knaagdieren14,15.
Deze test maakt gebruik van een Drosophila-model van PD waarin vliegen het menselijke alfa-synucleïne-gen tot expressie brengen onder controle van een pan-neuronale bestuurder, n-synaptobrevin. Deze vliegen vertonen alle kenmerkende kenmerken van PD, waaronder alfa-synucleïne-aggregatie, motorische disfunctie en leeftijdsgebonden neurodegeneratie, wat resulteert in het verlies van dopaminerge neuronen16,17. Eerdere studies hebben de meting van de fecale output bij vliegen geïntroduceerd om darmdisfunctie te beoordelen, de uitwerpselen van vliegen te kwantificeren en de uitwerpselen van verschillende genetische lijnen te vergelijken om functionele verschillen in het spijsverteringsstelsel aan het licht te brengen 18,19,20. Hier demonstreren we de constipatietest met behulp van vliegen die menselijke alfa-synucleïne tot expressie brengen. Dit eenvoudige maar waardevolle hulpmiddel maakt de studie van een belangrijk niet-motorisch symptoom van PD mogelijk.
Er zijn verschillende stappen in dit protocol die zullen helpen bij de succesvolle voltooiing van de test. Ten eerste is het belangrijk om ervoor te zorgen dat de tijdsintervallen tussen elke ronde voor elke injectieflacon gedurende het hele experiment consistent zijn. Door de flacons met nummers te labelen, vermijdt u de noodzaak van lange genotypebeschrijvingen, wat tijd bespaart. Bovendien is het van cruciaal belang dat de methode voor het tellen van ontlasting22 gedurende het hele experiment consistent blijft. Hoewel blauwe ontlasting zichtbaar is op het voedsel en de injectieflaconstop, is kleurloze ontlasting dat niet. Tel daarom de blauwe stippen op het voer of de flaconplug niet.
Bij gedragstesten is er altijd een mogelijkheid van inconsistenties in de resultaten als gevolg van fluctuaties in het gedrag van vliegen of onbekende variabelen die de test beïnvloeden. We raden aan om voor alle experimenten dezelfde Drosophila-media , dezelfde kleurstof voor levensmiddelen en hetzelfde merk injectieflacons te gebruiken. Interessant is dat in verschillende proeven werd waargenomen dat vliegen de neiging hebben om minder vaak te poepen in de vroege namiddag, mogelijk als gevolg van het circadiane ritme van de vliegen23. Dit gedrag is echter consistent bij zowel controlevliegen als vliegen die alfa-synucleïne tot expressie brengen, dus het zou geen zorgen moeten baren.
Als de vliegen aan het begin van de test geen blauwe ontlasting uitscheiden, is het mogelijk dat de gebruikte kleurstof niet voldoende gepigmenteerd is. In dit geval kan men de verhouding tussen kleurstof en gedestilleerd water dienovereenkomstig verhogen. Het is ook mogelijk dat wanneer er nog maar een kleine hoeveelheid blauw voedsel in het spijsverteringskanaal van de vlieg zit, het moeilijk kan zijn om te bepalen of de ontlasting lichtblauw of kleurloos is. Wanneer dit gebeurt, zal het plaatsen van een wit vel papier achter de injectieflacon helpen om de kleur van de fecale stip te bepalen. Zelfs als de ontlasting erg lichtblauw is, is het het beste om deze op te nemen als blauwe ontlasting in plaats van kleurloze ontlasting.
Een beperking van deze test is dat het handmatig tellen van fecale vlekken vereist. Om het potentieel voor high-throughput screening te verbeteren, kan dit protocol in de toekomst worden gewijzigd om geautomatiseerde kwantificering mogelijk te maken van blauwe fecale vlekken geproduceerd door individuele vliegen in platen met meerdere putjes. Een andere beperking is dat, hoewel het alfa-synucleïnemodel het potentieel heeft om te worden ontwikkeld tot een prodromaal model van PD, er nog geen optimaal tijdstip is geïdentificeerd waarop constipatie aanwezig is zonder neurodegeneratie.
Samenvattend biedt deze methode een eenvoudige, ongecompliceerde benadering voor het modelleren van constipatie, een onderbelicht niet-motorisch PD-symptoom, in een Drosophila-model van PD.
The authors have nothing to disclose.
We erkennen Dr. Mel Feany van het Brigham and Women’s Hospital en de Harvard Medical School voor het vriendelijke geschenk van de controle en alfa-synucleïne die Drosophila-lijnen tot expressie brengt. We erkennen de volgende bronnen van subsidie aan Dr. Olsen: NINDS K08, American Parkinson Disease Association George C. Cotzias Fellowship, Department of Defense Parkinson’s Disease Early Investigator Award.
1400 g sucrose | MP Biomedicals | 904713 | |
1800 g dextrose | MP Biomedicals | 901521 | |
2884 g yeast | MP Biomedicals | 903312 | |
428 g agar | Fisher Scientific | 10253156 | |
4600 mL molasses | Grandma's Molasses | 7971942 | |
68 L water | N/A | N/A | |
680 mL tegosept mix (1200 g tegosept in 6 L ethanol) | |||
6864 g cornmeal | Pearl Milling | 125045 | |
800 mL acid mix (83 mL phosphoric acid in 1 L water + 836 mL propionic acid in 1 L water) | |||
cellSens Standard software | Olympus | N/A | |
Ethanol | Pharmco-Aper | 111ACS200 | |
Flugs for wide plastic vials | Genesee Scientific | 49-101 | |
Flystuff wide Drosophila vials, polystyrene | Genesee Scientific | 32-117 | |
Graphpad Prism | GraphPad | N/A | Version 9.5.1 |
Olympus DP23 camera | Olympus | N/A | |
Olympus SZX12 Stereo Microscope | Olympus | N/A | |
Phosphoric Acid | Fisher Scientific | S25470A | |
Propionic Acid | Fisher Scientific | A258 – 500 | |
Soft gel paste food color, Royal blue | AmeriColor | 202 | |
Tegosept | Apex | 20-258 | |
Drosophila Stocks | |||
nSyb-QF2, nSyb-Gal4 | All lines provided by Dr. Mel Feany | N/A | Lines are available directly from Dr. Feany |
nSyb-QF2, nSyb-Gal4, QUAS-alpha synuclein | N/A | ||
w1118 | N/A |