SARS-CoV-2 Varyantlarının Hızlı Miktar Tayini ve Nötralize Edici Antikorlar için Ha-CoV-2 Psödovirüsünün Uygulanması

1. Virüs ve viral parçacık montajı Vektörler: SARS-CoV-2 M, E veya N’nin yanı sıra SARS-CoV-2 S (Vahşi tip, Wt), Delta (B.1.617.2) ve Omicron (B.1.1.529) için ticari olarak ekspresyon vektörleri satın alın.NOT: Ekspresyon vektörlerinin protein dizileri Ek Dosya 1’de verilmiştir. Bu ifade vektörlerinin satıcısı Malzeme Tablosu altında da bulunabilir. Hücreler ve hücre kültürü: Dulbecco’nun ısıyla inaktive edilmiş fetal sığır serumu (FBS), 50 birim / mL penisilin ve 50 μg / mL streptomisin içeren modifiye Eagle ortamında (DMEM) HEK293T hücreleri koruyun.NOT: Tüm hücre kültürü çalışmalarının laminer hava akımı biyogüvenlik kabininde yapılması gerekir. Polietilenimin (PEI) transfeksiyonu tipik olarak 5-6 saat inkübasyon gerektirir. Başlangıç zamanları önceden dikkatlice düşünülmelidir. Virüs montajı ve PEI bazlı kotransfeksiyon: Ha-CoV-2 partiküllerini HEK293T hücrelerin birlikte transfeksiyonu ile birleştirin. Kotransfeksiyondan bir gün önce 10 mL tam DMEM ortamında 10 cm’lik bir hücre kültürü Petri kabında (tabak başına4-5 x 10 6 hücre) tohum hücreleri. Bu çalışma için, sırasıyla Ha-CoV-2 vahşi tip, Delta ve Omicron’un montajı için hücreleri tohumlamak için üç Petri kabı kullanılmıştır. Petri kaplarını gece boyunca 37 °C’de bir CO2 inkübatöründe inkübe edin. Hücrelerin oranında birleştiğinden emin olmak için ertesi sabah bulaşıkları kontrol edin. Ortamın tamamını çıkarın ve 9 mL DMEM serumsuz besiyeri ile değiştirin. Her yemek için, SARS-CoV-2 yapısal protein ekspresyon vektörlerinin (N, E, M) her birinden 2,5 μg, 10 μg pAlphaPro-Luc-GFP-PreΨ (HaCoV2 Genomu) ve 2,5 μg S protein ekspresyon vektörü, Delta veya Omicron S varyantları ve 45 μL PEI bazlı transfeksiyon reaktifi içeren bir kotransfeksiyon karışımı hazırlayın. Kotransfeksiyon karışımının 13 dakika inkübe ederek kompleksler oluşturmasına izin verin (30 dakikadan fazla inkübe etmeyin). İnkübasyondan sonra, kotransfeksiyon karışımını her bir Petri kabına yavaşça, damla damla ekleyin. Bulaşıkları 37 °C’de 6 saat boyunca bir CO2 inkübatörüne yerleştirin. 6 saat sonra serumsuz DMEM’i çıkarın ve tam DMEM ortamı ile değiştirin. Kotransfeksiyondan 48-60 saat sonra virüsü hasat edin. Virüs toplama ve depolama: Kotransfeksiyondan 48 saat sonra parçacıkları hasat edin. Tek tabakanın yüzeyine tekrar tekrar pipetleyerek hücreleri ayırın ve her bir tabaktan hücreleri toplayın, 15 mL’lik santrifüj tüplerine koyun ve 5 dakika boyunca 400 x g’da santrifüjleyin. Süpernatanı toplayın ve 0.22 μM’lik bir filtreden geçirin. Ha-CoV-2 psödovirüsünü -80 °C’de saklayın. 2. Viral enfektivite testi Hücreler ve hücre kültürü: Dulbecco’nun ısıyla etkisiz hale getirilmiş FBS, 50 birim / mL penisilin ve 50 μg / mL streptomisin içeren modifiye Eagle ortamında (DMEM) HEK293T (ACE2 / TMPRSS2) hücrelerini koruyun. Tohumlama HEK293T (ACE2 / TMPRSS2) hücreleri: Viral enfektivite testinden bir gün önce, 50 μL tam DMEM ortamında 96 oyuklu bir plakada tohum HEK293T (ACE2 / TMPRSS2) hücreleri. Her 96 oyuklu plaka için, her oyuğa 2,5 x 104 hücre tohumlayın ve bir plaka için toplam 2,5 x 106 hücre gerekir. 96 oyuklu plakayı gece boyunca 37 °C’de bir CO2 inkübatöre yerleştirin. HEK293T enfeksiyonu (ACE2 / TMPRSS2): HEK293T (ACE2 / TMPRSS2) hücrelerini enfekte etmek için Ha-CoV-2 varyant partiküllerini kullanın. Enfeksiyon sabahı, önceden tohumlanmış 96 oyuklu plakadan 50 μL DMEM çıkarın. Ortamı 37 °C’de 18 saat boyunca 50 μL Ha-CoV-2 Wild tipi, Delta veya Omicron ile değiştirin.NOT: Enfeksiyon 18 saatlik inkübasyona ulaşana ve plaka Luciferaz Testi ile analiz edilmeye hazır olana kadar protokol burada durdurulabilir. Enfeksiyonun başarısı, enfekte hücrelerde eksprese edilen Luciferase raportör geninden kaynaklanan Luciferaz testi ile belirlenir, bu nedenle ne kadar çok sinyal üretilirse, Ha-CoV-2 varyantının enfeksiyonu o kadar başarılı olur. Lusiferaz deneyi: 18 saatlik inkübasyondan sonra, her bir oyuğa doğrudan 7.5 μL hücre lizis tamponu ekleyin ve 2 dakika boyunca orbital çalkalayarak karıştırın. Lizis içindeki hücreler, oda sıcaklığında en az 5 dakika bekletilir. D-lusiferin çözeltisini Firefly lusiferaz test çözeltisi ile 1:50 oranında karıştırarak Firefly lusiferaz test çözeltisini hazırlayın. 96 oyuklu bir plaka için, 3 mL lusiferaz substrat çözeltisini 60 μL D-lusiferin çözeltisi ile 2940 μL Firefly lusiferaz tampon çözeltisi ile birleştirin. Hücre lizatlarına 25 μL Firefly lusiferaz tahlil çözeltisi ekleyin ve plakayı 1 dakika boyunca yörüngesel çalkalayarak karıştırın. Ticari bir lusiferaz mikroplaka okuyucu kullanarak lusiferaz aktivitesini analiz edin. 3. Ha-CoV-2 ve kantitatif ters transkriptaz PCR’nin (RT-qPCR) RNA ekstraksiyonu Viral RNA ekstraksiyonu: Üreticinin talimatlarını izleyerek ticari bir viral RNA ekstraksiyon kiti kullanarak Ha-CoV-2 Wild tipi ve Ha-CoV-2 Delta ve Omicron varyant parçacıklarından viral RNA’yı çıkarın. Ekstrakte edilen viral RNA’yı -80 °C’de saklayın veya RT-qPCR için hemen kullanın. RT-qPCR: Tek adımlı bir ana karışım kullanarak viral RNA üzerinde RT-qPCR gerçekleştirin. Reaksiyonu ticari bir PCR makinesinde gerçekleştirin. Amplifikasyon hedefinin Ha-CoV-2’nin genomik RNA’sı olduğunu lütfen unutmayın. Standart bir eğri oluşturmak ve her varyantın RNA kopya sayısını hesaplamak için standart olarak Ha-CoV-2 vektör DNA’sını kullanın. 4. Nötralize edici antikor testi Tohumlama HEK293T (ACE2 / TMPRSS2) hücreleri: Testten bir gün önce, 50 μL tam DMEM ortamında 96 oyuklu bir plakada HEK293T (ACE2 / TMPRSS2) hücrelerini tohumlayın. HEK293T (ACE2 / TMPRSS2) hücreleri ticari olarak satın alınır. Hücreleri saymak için, HEK293T (ACE2 / TMPRSS2) hücreleri içeren bir T75 şişesinden 20 μL hücre elde edin ve 20 μL tripan mavisi çözeltisi ile karıştırın. Bu karışımdan 20 μL’yi hücre sayma odasına ekleyin ve mL’deki hücre sayısını sayın. Enfeksiyon için 96 oyuklu bir plakayı tohumlamak için, oyuk başına 2,5 x 104 hücre kullanın ve toplamda 2,5 x 106 hücreye ihtiyaç duyulacaktır. 96 oyuklu plakayı gece boyunca 37 °C’de bir CO2 inkübatöre yerleştirin. Nötralize edici antikor testi: Steril bir polipropilen 96 oyuklu plakada, standart 27BV nötralize edici antikor ve Ha-CoV-2 karışımını hazırlayın. Plakaya 8 μL 27BV (45 mg / mL) ekleyin ve 6 μL serumsuz DMEM ile antikorun seri dilüsyonlarını gerçekleştirin.NOT: Kuyu transferleri arasında pipet uçlarını değiştirdiğinizden ve doğru sonuçlar elde etmek için antikor ile serumsuz ortamın iyice karıştırıldığından emin olun. Seri olarak seyreltilmiş antikora 54 μL Ha-CoV-2 partikülü ekleyin ve virüs ile antikoru karıştırın. Ha-CoV-2 partiküllerini seri olarak seyreltilmiş 27BV ile 37 °C’de %5 CO2’de 1 saat önceden inkübe edin. 1 saatlik inkübasyondan sonra, bir gün önce tohumlanan HEK293T (ACE2 / TMPRSS2) hücrelerini (oyuk başına 2.5 x 104 hücre) içeren 96 oyuklu plakaya 50 μL antikor ve Ha-CoV-2 karışımı uygulayın. Kontroller için, yalnızca HEK293T (ACE2 / TMPRSS2) hücrelerini içeren en az üç kuyu bırakın. Lusiferaz tahlil okumalarının arka plan sinyali için enfekte olmayan kuyucuklar olarak hizmet etmek üzere bu kuyucuklara 50 μL tam ortam ekleyin.NOT: Enfeksiyon 37 ° C’de 18 saatlik inkübasyona ulaşana kadar protokol burada durdurulabilir ve daha sonra plaka lusiferaz testi ile analiz edilmeye hazır hale gelir. Lusiferaz deneyi: 18 saatlik inkübasyondan sonra, her bir oyuğa doğrudan 7.5 μL lizis tamponu ekleyin ve 2 dakika boyunca yörüngesel çalkalayarak karıştırın. Lizis içindeki hücreler, oda sıcaklığında en az 5 dakika bekletilir. D-lusiferin çözeltisini Firefly lusiferaz test çözeltisi ile 1:50 oranında karıştırarak Firefly lusiferaz test çözeltisini hazırlayın. 96 oyuklu bir plakanın tamamı için, 3 mL lusiferaz substrat çözeltisini 60 μL D-lusiferin çözeltisi ile 2940 μL ateşböceği lusiferaz tampon çözeltisi ile birleştirin. Hücre lizatlarına 25 μL Firefly lusiferaz tahlil çözeltisi ekleyin ve plakayı 1 dakika boyunca yörüngesel çalkalayarak karıştırın. Ticari bir lusiferaz mikroplaka okuyucu kullanarak lusiferaz aktivitesini analiz edin. 5. Niceleme ve istatistiksel analiz Veri toplama: Enfeksiyon ve lusiferaz testlerini belirtildiği gibi üç kopya halinde gerçekleştirin (Şekil 1). Lusiferaz tahlil okumaları ile lusiferaz ekspresyonunu ölçün. Ortalama, üç lusiferaz tahlil okumasının ortalama değeridir. Enfekte olmayan kuyulardan alınan arka plan sinyal okumaları bu ortalama değerden çıkarılır. Standart sapma (SD), lusiferaz tahlil okumalarının ortalama değerinden belirlenir. Veri analizi: Ticari grafik yazılımı kullanarak antikor nötralizasyon aktivitesini çizin ve ID50 ( inhibisyon dozu) değerlerini hesaplayın. ID50 değeri, HEK293T (ACE2 / TMPRSS2) hücrelerinin enfeksiyonunda (lusiferaz test okumalarına dayanarak) ‘lik bir azalmanın elde edildiği antikor inhibitör dilüsyonları olarak tanımlanır.