Ha-CoV-2假病毒在SARS-CoV-2变异株和中和抗体快速定量中的应用

1. 病毒和病毒颗粒组装 载体：以商业方式购买 SARS-CoV-2 M、E 或 N 以及 SARS-CoV-2 S（野生型，Wt）、Delta （B.1.617.2） 和 Omicron （B.1.1.529） 的表达载体。注意：表达载体的蛋白质序列在 补充文件1中提供。这些表达向量的供应商也可以在 材料表下找到。 细胞和细胞培养：在含有 10% 热灭活胎牛血清 （FBS）、50 单位/mL 青霉素和 50 μg/mL 链霉素的 Dulbecco 改良 Eagle 培养基 （DMEM） 中维持 HEK293T 细胞。注意：所有细胞培养工作都需要在层流生物安全柜中完成。聚乙烯亚胺 （PEI） 转染通常需要 5-6 小时孵育。需要事先仔细考虑开始时间。 病毒组装和基于 PEI 的共转染：通过HEK293T细胞共转染组装 Ha-CoV-2 颗粒。在共转染前一天，在 10 mL 完全 DMEM 培养基中将细胞接种在 10 cm 细胞培养皿（每个培养皿 4-5 x 106 个细胞）中。在这项研究中，使用三个培养皿分别用于接种用于组装 Ha-CoV-2 野生型、Delta 和 Omicron 的细胞。 将培养皿在37°C的CO2 培养箱中孵育过夜。 第二天早上检查培养皿，确保细胞80%汇合。取出完全培养基，并用 9 mL DMEM 无血清培养基替换。 对于每个培养皿，制备共转染混合物，其中包含 2.5 μg SARS-CoV-2 结构蛋白表达载体（N、E、M）、10 μg pAlphaPro-Luc-GFP-PreΨ（HaCoV2 基因组）和 2.5 μg S 蛋白表达载体（Delta 或 Omicron S 变体）和 45 μL 基于 PEI 的转染试剂。通过孵育 13 分钟（孵育时间不要超过 30 分钟）让共转染混合物形成复合物。 孵育后，将共转染混合物缓慢地逐滴加入每个培养皿中。将培养皿置于37°C的CO2 培养箱中6小时。6小时后，除去无血清DMEM，并用完全DMEM培养基代替。共转染后48-60小时收获病毒。 病毒收集和储存：共转染后 48 小时收获颗粒。通过在单层表面反复移液分离细胞，并从每个培养皿中收集细胞，放入15mL离心管中，并以400× g 离心5分钟。收集上清液并通过0.22μM过滤器。将Ha-CoV-2假病毒储存在-80°C。 2.病毒感染性测定 细胞和细胞培养：在含有 10% 热灭活 FBS、50 单位/mL 青霉素和 50 μg/mL 链霉素的 Dulbecco 改良 Eagle 培养基 （DMEM） 中维持 HEK293T （ACE2/TMPRSS2） 细胞。 接种 HEK293T （ACE2/TMPRSS2） 细胞：在病毒感染性测定的前一天，将 HEK293T（ACE2/TMPRSS2） 细胞接种在 96 孔板中的 50 μL 完全 DMEM 培养基中。对于每个 96 孔板，将 2.5 x 104 个细胞接种到每个孔中，一个板总共需要 2.5 x 106 个细胞。将96孔板置于37°C的CO2 培养箱中过夜。 HEK293T（ACE2/TMPRSS2）感染：使用Ha-CoV-2变体颗粒感染HEK293T（ACE2/TMPRSS2）细胞。在感染的早晨，从预先接种的 96 孔板中取出 50 μL DMEM。在37°C下用50μLHa-CoV-2野生型，Delta或Omicron替换培养基18小时。注意：可以在此处停止该方案，直到感染达到孵育18小时，并且板已准备好通过荧光素酶测定进行分析。感染的成功取决于由感染细胞中表达的荧光素酶报告基因产生的荧光素酶测定，因此产生的信号越多，Ha-CoV-2变体的感染就越成功。 荧光素酶测定：孵育 18 小时后，将 7.5 μL 细胞裂解缓冲液直接加入每个孔中，并通过轨道振荡混合 2 分钟。在室温下将裂解细胞在裂解缓冲液中裂解至少5分钟。 通过将D-荧光素溶液与萤火虫荧光素酶测定溶液以1：50的比例混合来制备萤火虫荧光素酶测定溶液。对于整个 96 孔板，将 3 mL 荧光素酶底物溶液与 60 μL D-荧光素溶液与 2940 μL Firefly 荧光素酶缓冲液混合。 向细胞裂解物中加入25μL萤火虫荧光素酶测定溶液，并通过轨道振荡1分钟混合板。使用商业荧光素酶 3. Ha-CoV-2 的 RNA 提取和定量逆转录酶 PCR （RT-qPCR） 病毒 RNA 提取：按照制造商的说明，使用商业病毒 RNA 提取试剂盒从 Ha-CoV-2 野生型和 Ha-CoV-2 Delta 和 Omicron 变体颗粒中提取病毒 RNA。将提取的病毒RNA储存在-80°C或立即用于RT-qPCR。 RT-qPCR：使用一步法预混液对病毒RNA进行RT-qPCR。在商用PCR机中进行反应。请注意，扩增的靶标是 Ha-CoV-2 的基因组 RNA。使用 Ha-CoV-2 载体 DNA 作为标准品，用于创建标准曲线并计算每个变体的 RNA 拷贝数。 4.中和抗体测定 接种 HEK293T （ACE2/TMPRSS2） 细胞：在测定前一天，将 96 孔板中的 HEK293T （ACE2/TMPRSS2） 细胞接种在 50 μL 完整的 DMEM 培养基中。HEK293T（ACE2/TMPRSS2）电池是商业购买的。 对于细胞计数，从含有 HEK293T（ACE2/TMPRSS2） 细胞的 T75 烧瓶中获取 20 μL 细胞，并与 20 μL 台盼蓝溶液混合。将 20 μL 该混合物加入细胞计数室并计数每 mL 的细胞数。要接种 96 孔板进行感染，每孔使用 2.5 x 104 个细胞，总共需要 2.5 x 106 个细胞。将96孔板置于37°C的CO2 培养箱中过夜。 中和抗体测定：在无菌聚丙烯 96 孔板中，制备标准 27BV 中和抗体和 Ha-CoV-2 混合物。向板中加入 8 μL 27BV （45 mg/mL），并用 6 μL 无血清 DMEM 连续稀释抗体。注意：请务必在孔转移之间交换移液器吸头，并确保抗体和无血清培养基充分混合以产生准确的结果。 向连续稀释的抗体中加入 54 μL Ha-CoV-2 颗粒，并将病毒和抗体混合。在37°C下以5%CO2连续稀释的27BV预孵育Ha-CoV-2颗粒1小时。孵育 1 小时后，将 50 μL 抗体和 Ha-CoV-2 混合物施加到含有前一天接种的 HEK293T（ACE2/TMPRSS2） 细胞（每孔 2.5 x 104 个细胞）的 96 孔板上。 对于对照，至少留出三个仅含有 HEK293T（ACE2/TMPRSS2） 细胞的孔。向这些孔中加入 50 μL 完全培养基，作为荧光素酶测定读数的背景信号的非感染孔。注意：可以在此处停止该方案，直到感染在37°C下达到孵育18小时，然后准备通过荧光素酶测定分析板。 荧光素酶测定：孵育18小时后，将7.5μL裂解缓冲液直接加入每个孔中，并通过轨道振荡混合2分钟。在室温下将裂解细胞在裂解缓冲液中裂解至少5分钟。 通过将D-荧光素溶液与萤火虫荧光素酶测定溶液以1：50的比例混合来制备萤火虫荧光素酶测定溶液。对于整个 96 孔板，将 3 mL 荧光素酶底物溶液与 60 μL D-荧光素溶液与 2940 μL 萤火虫荧光素酶缓冲液混合。 向细胞裂解物中加入25μL萤火虫荧光素酶测定溶液，并通过轨道振荡1分钟混合板。使用商业荧光素酶 5. 量化和统计分析 数据收集：如图所示，一式三份进行感染和荧光素酶测定（图1）。使用荧光素酶测定读数定量荧光素酶表达。平均值是三个荧光素酶测定读数的平均值。从该平均值中减去来自非感染孔的背景信号读数。标准偏差 （SD） 由荧光素酶测定读数的平均值确定。 数据分析：绘制抗体中和活性图，并使用商业绘图软件计算ID50 （50%抑制剂量）值。ID50 值定义为抗体抑制稀释度，在该稀释度下，HEK293T（ACE2/TMPRSS2） 细胞感染减少 50%（基于荧光素酶测定读数）。