SARS-CoV-2 변이체 및 중화 항체의 신속한 정량화를 위한 Ha-CoV-2 슈도바이러스 적용
Özet
이 프로토콜은 SARS-CoV-2 변이체의 감염성과 중화 항체에 대한 민감도를 신속하게 정량화하기 위한 플랫폼으로 새로운 하이브리드 알파바이러스-SARS-CoV-2 슈도바이러스(Ha-CoV-2)의 적용을 설명합니다.
Abstract
코로나바이러스 질병 2019 팬데믹(COVID-19)은 신종 SARS-CoV-2 변이체의 감염성과 바이러스 변이체에 대한 백신 유도 중화 항체의 효과를 정확하게 측정하기 위한 신속한 분석의 필요성을 강조했습니다. 이러한 분석은 팬데믹 감시와 백신 및 변이별 부스터 샷 검증에 필수적입니다. 이 원고는 SARS-CoV-2 변종 감염성 및 바이러스 변종에 대한 백신 유도 중화 항체의 빠른 정량화를 위해 새로운 하이브리드 알파바이러스-SARS-CoV-2 슈도바이러스(Ha-CoV-2)의 적용을 보여줍니다. Ha-CoV-2는 바이러스 구조 단백질(S, M, N, E)과 알파바이러스인 셈리키 숲 바이러스(SFV)에서 유래한 빠르게 발현되는 RNA 게놈으로 구성된 SARS-CoV-2 바이러스 유사 입자입니다. Ha-CoV-2는 또한 녹색 형광 단백질(GFP)과 루시페라아제 리포터 유전자를 모두 포함하고 있어 바이러스 감염도를 빠르게 정량화할 수 있습니다. 예를 들어, SARS-CoV-2 델타(B.1.617.2) 및 오미크론(B.1.1.529) 변이의 감염도를 정량화하고 중화 항체(27VB)에 대한 민감도도 측정합니다. 이러한 예는 SARS-CoV-2 변이체와 중화 항체에 대한 감수성의 신속한 정량화를 위한 강력한 플랫폼으로서 Ha-CoV-2의 큰 잠재력을 보여줍니다.
Introduction
2023년 5월 현재 COVID-19 확진자는 7억 6,600만 명을 넘어섰습니다1. 전 세계적인 예방 접종 캠페인에도 불구하고 SARS-CoV-2는 델타(B.1.617.2) 및 오미크론(B.1.1.529)과 같은 새로운 변종의 출현으로 인해 지속적으로 순환하고 사람들을 감염시킵니다 2,3,4. SARS-CoV-2가 지속적으로 진화하고 있다는 점을 감안할 때 새로운 변이의 감염성과 이러한 변이에 대한 백신 유도 중화 항체의 효과를 정확하게 측정할 수 있는 빠른 분석을 개발하는 것이 중요합니다. 이러한 분석은 팬데믹 감시와 백신 및 변이 바이러스별 부스터의 효능을 결정하는 데 필수적입니다.
SARS-CoV-2의 전염성이 높기 때문에 질병통제예방센터(CDC)는 SARS-CoV-2 및 그 변종에 대한 연구를 생물안전 수준(BSL) 3 시설 5,6에서 수행할 것을 요구합니다. 이 BSL-3 요구 사항은 일반 연구 및 임상 실험실에서 바이러스 변이체 및 중화 항체의 감염성을 정량화하기 위해 살아있는 바이러스의 사용을 제한합니다. 또한, 복제가 가능한 살아있는 바이러스를 사용하는 플라크 또는 세포병증 효과 기반 분석법과 같은 기존의 SARS-CoV-2 중화 분석법은 시간이 많이 걸리고 긴 잠복기가 필요하다7. 중화 항체 8,9,10,11,12의 효과를 정량화하기 위해 여러 스파이크(S) 단백질 유사형 SARS-CoV-2 유사바이러스가 개발되었습니다. SARS-CoV-2에서 S 단백질은 바이러스 진입을 매개하는 주요 단백질입니다13, SARS-CoV-2 백신 9,10,14,15,16에 사용되는 주요 항원입니다. 수포성 구내염 바이러스(VSV-G) 또는 렌티바이러스와 같은 S 단백질 유사형 비리온은 중화 항체 17,18,19의 정량화에 사용되었습니다. 그럼에도 불구하고, 렌티바이러스 기반 유사 바이러스는 보고자 신호를 정량화하기 위해 일반적으로 2-3일의 감염이 필요합니다. VSV 기반 유사 바이러스 시스템에는 잔류 VSV 바이러스가 포함되어 있는 경우가 많으며, 이로 인해 위양성 결과가 발생할 수 있으며 일반적으로 24시간 동안 감염이 필요합니다20.
새로운 SARS-CoV-2 유사바이러스 시스템인 하이브리드 알파바이러스-SARS-CoV-2 유사바이러스(Ha-CoV-2)가 최근 Hetrick etal 12에 의해 개발되었습니다. Ha-CoV-2는 일반적인 BSL-2 실험실에서 바이러스 감염률과 중화 항체에 대한 바이러스 민감도를 신속하게 정량화할 수 있는 새로운 도구를 제공합니다. 구조적으로 Ha-CoV-2는 SARS-CoV-2 비리온 입자와 유사하며, S 단백질(S), 막(M), 뉴클레오캡시드(N) 및 외피(E)를 포함한 SARS-CoV-2 구조 단백질로 구성되어 있으며 다른 바이러스의 구조 단백질은 없습니다. 또한 Ha-CoV-2 입자는 세포에서 빠른 리포터 발현을 위해 알파바이러스의 빠르게 발현되는 RNA 게놈을 포함합니다. Ha-CoV-2는 백신 접종을 받은 사람 및 회복기 환자의 혈청에서 항체의 중화 활성을 빠르게 측정하는 것으로 나타났다12. Hetrick et al.에 의해 입증된 바와 같이, 시간 경과 분석에서 렌티바이러스 기반 SARS-CoV-2 유사 바이러스와 비교했을 때, Ha-CoV-2는 감염 후 2-4시간 이내에 Luc 리포터를 발현한 반면, 렌티바이러스-유사 바이러스는 24시간 후 Luc를 발현했습니다12. 또한, 중화 항체를 정량화하기 위한 Ha-CoV-2 변이체의 잠재적 응용은 표준 단클론 중화 항체인 27BV를 사용하여 추가로 입증됩니다( 보충 그림 1 참조)12. 이 연구에서는 델타(B.1.617.2) 및 오미크론(B.1.1.529) 변종을 예로 들어 SARS-CoV-2 변종의 감염력을 신속하게 정량화하기 위해 Ha-CoV-2 플랫폼을 사용하는 방법을 자세히 설명합니다. 또한, 중화 항체를 정량화하기 위한 Ha-CoV-2 변이체의 잠재적 응용은 표준 단클론 중화 항체인 27BV12를 사용하여 추가로 입증됩니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
Ha-CoV-2 플랫폼은 바이러스 변이체를 정량화하고 항체를 중화하기 위한 빠르고 강력하며 간단한 워크플로우를 제공합니다. 그러나 주의가 필요한 몇 가지 중요한 단계가 있습니다. Ha-CoV-2 유사 바이러스의 생산은 생존력이 높은 HEK293T 세포를 사용하여 수행해야 합니다. cotransfection 효율은 Ha-CoV-2 게놈의 GFP 리포터 유전자를 사용하여 transfection 후 24시간 동안 모니터링할 수 있습니다. Ha-CoV-2 게놈은 2개의 리포터(GFP 및 Luc)를 포함할 수 있으며, GFP는 표적 세포의 cotransfection 및 Ha-CoV-2 감염 후 발현될 수있다 12. 감염으로 인한 GFP+ 세포는 일반적으로 낮은 비율(1%에서 5%)이지만 감염된 각 세포는 강력한 GFP 신호를 나타냅니다(그림 3). 이 낮은 GFP 백분율은 감염된 세포의 전체적인 인구를 정량화하는 Luc 보고자와 비교된 항체 중화를 정량화하기를 위한 튼튼한 독서로 GFP의 사용을, 제한할지도 모릅니다.
중화 분석을 수행할 때 웰 이송 간에 피펫 팁을 변경하고 항체와 무혈청 배지가 완전히 혼합되어 정확한 결과를 얻을 수 있도록 하는 것이 중요합니다. 또한 루시페라아제 분석 프로토콜을 수행할 때 세포의 완전한 용해와 루시페라아제 효소의 방출을 보장하기 위해 최소 3분 동안 세포를 완전히 용해해야 합니다. 이렇게 하면 분석의 정확성이 보장됩니다. 또한, Firefly 루시페라아제 분석 용액이 광학 백색벽 96웰 플레이트에 추가되면, 초기 광 방출이 높지만 ATP가 고갈됨에 따라 시간이 지남에 따라 감소하기 때문에 플레이트를 10분 이내에 분석해야 합니다21.
더 많은 SARS-CoV-2 변이가 계속 진화함에 따라 Ha-CoV-2와 같은 플랫폼이 변이 감염성 및 백신 유도 중화 항체에 대한 변이 민감도를 신속하게 스크리닝해야 할 필요성이 증가하고 있습니다. Ha-CoV-2 플랫폼은 기존 유사 바이러스 기반 중화 분석에 비해 더 빠른 속도, 더 높은 신호 대 잡음비 및 간단한 프로토콜을 제공합니다 8,9,10,11. Ha-CoV-2 플랫폼은 또한 BSL-2 실험실에서 사용할 수 있고 BSL-3 시설을 사용할 필요가 없다는 이점을 제공합니다. 이를 통해 SARS-CoV-2는 일반 연구 및 임상 실험실에서 연구를 진행할 수 있습니다. 또한 Ha-CoV-2 플랫폼은 다른 시스템에 비해 빠른 결과를 제공합니다. 예를 들어, 전염성 SARS-CoV-2 바이러스에 대한 중화 항체 연구는 종종 플라크 감소 중화 테스트(PRINT)22를 사용합니다. PRINT는 신뢰할 수 있는 결과를 생성하지만, 플라크 형성 단위(PFU)의 수동 계수는 느리고 결과를 얻는 데 3-5일이 소요됩니다 23,24. 렌티바이러스-슈도바이러스(lentivirus-pseudovirus)와 같은 다른 유사형 시스템은 검출 가능한 리포터 신호(12)를 생성하기 위해 24-72시간이 필요하다. 이에 비해 Ha-CoV-2 중화 분석은 18시간 이내에 결과를 생성할 수 있습니다. Ha-CoV-2는 바이러스 변이체의 신속한 스크리닝 및 정량화와 팬데믹 모니터링을 위한 중화 항체를 위한 편리한 도구를 제공합니다.
SARS-CoV-2의 감염성 모니터링은 더 많은 우려 변이(VOC)가 계속 등장함에 따라 필수적입니다. Ha-CoV-2는 VOC의 감염성을 신속하게 결정할 수 있는 이점을 제공합니다. 이전 연구에서는 인공 지능(AI) 기반 모델링을 사용하여 오미크론 하위 변종과 델타 변종25와 같은 다른 SARS-CoV-2 변종의 감염력을 정량적으로 분석했습니다. 이 연구는 오미크론 변이가 원래 바이러스보다 전염성이 더 강하고 중화항체를 회피할 가능성이 더 높다는 것을 보여주었다25. 이 연구에서 Ha-CoV-2를 사용하여 유사한 표현형이 관찰되었습니다. 또한 항체 중화 분석에서 오미크론 변이는 우한 및 델타 균주보다 27BV에 의해 중화될 가능성이 10배 낮습니다. 이러한 결과는 또한 수용체 결합 도메인(RBD)에 최소 15개의 돌연변이가 있는 오미크론 변이의 전염성이 더 높다고 보고된 것과 일치하며, ACE2 수용체에 대한 바이러스 결합 친화도를 향상시켜 더 높은 전염성과 더 큰 면역 회피를 가능하게 할 가능성이 있다26.
Açıklamalar
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 연구는 조지 메이슨 대학교 내부 연구 기금의 지원을 받았습니다.
Materials
| 27VB1 20 µg SARS-CoV-2 Standard Neutralizing Antibody | Virongy Biosciences | 27VBI-01 | |
| 500 mL – US Origin FBS | Neuromics | FBS001 | |
| AB Mixing Plate: Olympus 96-Well PCR Plate, Non-Skirted UltraThin Wall, Natural, 25 Plates/Unit | Genesee Scientific | Cat# 24-300 | |
| Allegra 6R Centrifuge | Beckman Coulter | 2043-30-1158 | |
| DMEM (1x) | ThermoFisher | 11995-073 | |
| GenClone 25-209, TC Treated Flasks, 250ml, Vent Growth Area: 75.0cm2, 5 per Sleeve, 100 Flasks/Unit | Genesee Scientfic | 25-209 | |
| GlowMax Discover Microplate reader | Promega | GM3000 | |
| Ha-CoV-2 E Vector | Virongy Biosciences | pCoV2_E | |
| Ha-CoV-2 M Vector | Virongy Biosciences | pCoV2_M | |
| Ha-CoV-2 N Vector | Virongy Biosciences | pCoV2_N | |
| Ha-CoV-2 WT S Vector | Virongy Biosciences | pCoV2_WT S | |
| Hek293T cells | ATCC | CRL-3214 | |
| Illumination Firefly Luciferase Enhanced Assay Kit 1000 assays | Gold Bio | I-930-1000 | |
| Infection Plate: 96-Well Tissue Culture Plate, Greiner Bio-One (With Lid, μClear White Flat Round, Chimney) | VWR | Cat# 82050-758 | |
| pAlphaPro-Luc-GFP-PreΨ (Ha-CoV-2 Genome) Vector | In house | ||
| PEI-based Transfection Reagent | Virongy Biosciences | Transfectin | |
| Penicillin-Streptomycin-Glutamine (100X) | Invitrogen | 10378016 | |
| Polyethylenimine, branched | Millipore Sigma | 408727-100ML | |
| QuantStudio 7 Pro Real-Time PCR System | ThermoFisher | A43163 | |
| Ready to use (HEK293T)(ACE2/TMPRSS2) Cells | Virongy Biosciences | Ready-To-Use-Cells | |
| SARS-CoV-2 S Omicron (B.1.1.529) Vector | Virongy Biosciences | pCoV2-B.1.1.529 | |
| SARS-CoV-2 S Delta (B.1.617.2) Vector | Virongy Biosciences | pCoV2- B.1.617.2 | |
| Syringe Filters, PES, 0.22µm | Genesee Scientfic | 25-244 | |
| TaqMan Fast Virus 1-Step Master Mix | ThermoFisher | 4444432 | |
| Trypan Blue Solution, 0.4% | ThermoFisher | 15250061 |
Referanslar
- World Health Organization. . Weekly epidemiological update on COVID-19. 143, 1 (2023).
- Dhama, K., et al. Global emerging Omicron variant of SARS-CoV-2: Impacts, challenges and strategies. Journal of Infection and Public Health. 16 (1), 4-14 (2023).
- Dhama, K., et al. Coronavirus Disease 2019-COVID-19. Clinical Microbiology Reviews. 33 (4), e00028-e00020 (2020).
- El-Shabasy, R. M., et al. Three waves changes, new variant strains, and vaccination effect against COVID-19 pandemic. International Journal of Biological Macromolecules. 204, 161-168 (2022).
- CDC. . Interim laboratory biosafety guidelines for handling and processing specimens associated with coronavirus disease 2019 (COVID-19). , (2021).
- Kaufer, A., Theis, T., Lau, K., Gray, J., Rawlinson, W. Laboratory biosafety measures involving SARS-CoV-2 and the classification as a Risk Group 3 biological agent. Pathology. 52 (7), 790-795 (2020).
- Vanderheiden, A., et al. Development of a Rapid Focus Reduction Neutralization Test Assay for Measuring SARS-CoV-2 Neutralizing Antibodies. Current Protocols in Immunology. 131 (1), e116 (2020).
- Dieterle, M. E., et al. A Replication-Competent Vesicular Stomatitis Virus for Studies of SARS-CoV-2 Spike-Mediated Cell Entry and Its Inhibition. Cell Host & Microbe. 28 (3), 486-496 (2020).
- Nie, J., et al. Quantification of SARS-CoV-2 neutralizing antibody by a pseudotyped virus-based assay. Nature Protocols. 15 (11), 3699-3715 (2020).
- Nie, J., et al. Establishment and validation of a pseudovirus neutralization assay for SARS-CoV-2. Emerging Microbes & Infections. 9 (1), 680-686 (2020).
- Yang, R., et al. Development and effectiveness of pseudotyped SARS-CoV-2 system as determined by neutralizing efficiency and entry inhibition test in vitro. Biosafety and Health. 2 (4), 226-231 (2020).
- Hetrick, B., et al. Development of a hybrid alphavirus-SARS-CoV-2 pseudovirion for rapid quantification of neutralization antibodies and antiviral drugs. Cell reports methods. 2 (3), 100181 (2022).
- Jackson, C., Farzan, M., Chen, B., Choe, H. Mechanisms of SARS-CoV-2 entry into cells. Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 23 (1), 3-20 (2022).
- Jackson, L. A., et al. An mRNA Vaccine against SARS-CoV-2 – Preliminary Report. The New England Journal of Medicine. 383 (20), 1920-1931 (2020).
- Polack, F. P., et al. Safety and Efficacy of the BNT162b2 mRNA Covid-19 Vaccine. The New England Journal of Medicine. 383 (27), 2603-2615 (2020).
- Li, F. Structure, function, and evolution of coronavirus spike proteins. Annual Review of Virology. 3 (1), 237-261 (2016).
- Donofrio, G. A Simplified SARS-CoV-2 Pseudovirus Neutralization Assay. Vaccines. 9 (4), 389 (2021).
- Crawford, K. H. D., et al. Protocol and Reagents for Pseudotyping Lentiviral Particles with SARS-CoV-2 Spike Protein for Neutralization Assays. Viruses. 12 (5), 513 (2020).
- Zettl, F., et al. Rapid Quantification of SARS-CoV-2-Neutralizing Antibodies Using Propagation-Defective Vesicular Stomatitis Virus Pseudotypes. Vaccines. 8 (3), 386 (2020).
- Li, Q., Liu, Q., Huang, W., Li, X., Wang, Y. Current status on the development of pseudoviruses for enveloped viruses. Reviews in Medical Virology. 28 (1), e1963 (2018).
- Lundin, A. Optimization of the firefly luciferase reaction for analytical purposes. Advances in Biochemical Engineering/Biotechnology. 145, 31-62 (2014).
- Deshpande, G. R., et al. Neutralizing antibody responses to SARS-CoV-2 in COVID-19 patients. The Indian Journal of Medical Research. 152 (1 & 2), 82-87 (2020).
- Chen, C., et al. Research progress in methods for detecting neutralizing antibodies against SARS-CoV-2. Analytical Biochemistry. 673, 115199 (2023).
- Manischewitz, J., et al. Development of a novel vaccinia-neutralization assay based on reporter-gene expression. The Journal of Infectious Diseases. 188 (3), 440-448 (2003).
- Chen, J., Wang, R., Gilby, N., Wei, G. Omicron Variant (B.1.1.529): Infectivity, Vaccine Breakthrough, and Antibody Resistance. Journal of Chemical Information and Modeling. 62 (2), 412-422 (2022).
- Saxena, S. K., et al. Characterization of the novel SARS-CoV-2 Omicron (B.1.1.529) variant of concern and its global perspective. Journal of Medical Virology. 94 (4), 1738-1744 (2022).
