Preparation of Hard Palm Seeds for Matrix-Assisted Laser Desorption/Ionization-Imaging Mass Spectrometry Analysis
Özet
이 프로토콜은 MALDI-IMS 분석을 위해 수분 함량이 낮은 경질 종자 샘플 절편 준비에 대한 자세한 지침을 설명하고, 분석물의 원래 분포 및 풍부도를 유지하고, 고품질 신호 및 공간 분해능을 제공하는 것을 목표로 했습니다.
Abstract
매트릭스 보조 레이저 탈착/이온화 이미징 질량분석법(MALDI-IMS)은 기본 환경에서 화합물을 식별하는 데 적용됩니다. 현재 MALDI-IMS는 임상 분석에 자주 사용됩니다. 그럼에도 불구하고 식물 조직에서 화합물의 생리학적 정보를 이해하기 위해 이 기술을 더 잘 적용할 수 있는 훌륭한 관점이 존재합니다. 그러나 MALDI-IMS는 적절한 데이터 수집 및 성공적인 분석을 위해 얇은 슬라이스(12-20μm)가 필요하기 때문에 식물 재료의 특정 샘플에 대한 준비가 어려울 수 있습니다. 이러한 의미에서 이전에는 Euterpe oleracea (açaí palm) 경질 종자의 얇은 부분을 얻기 위한 샘플 준비 프로토콜을 개발하여 MALDI-IMS에 의한 분자 매핑을 가능하게 했습니다.
여기에서 우리는 개발 된 프로토콜이 동일한 속의 다른 종자를 준비하는 데 적합하다는 것을 보여줍니다. 간단히 말해서, 프로토콜은 씨앗을 탈이온수에 24시간 동안 담그고, 샘플을 젤라틴으로 삽입하고, 순응된 저온 유지 장치에서 절단하는 것을 기반으로 했습니다. 그런 다음 매트릭스 증착을 위해 1:1(v/v) 2,5-디하이드록시벤조산(DHB) 및 30mg/mL에서 0.1% 트리플루오로아세트산이 포함된 메탄올 용액을 사용하여 xy 모션 플랫폼을 전기분무 이온화(ESI) 니들 스프레이에 결합했습니다. E. precatoria 및 E. edulis 종자 데이터는 대사 산물 패턴을 매핑하기 위해 소프트웨어를 사용하여 처리되었습니다.
헥소스 올리고머는 샘플 조각 내에서 매핑되어 해당 샘플에 대한 프로토콜의 적절성을 증명했으며, 이러한 씨앗에는 헥소스 만노스의 중합체인 만난이 다량 포함되어 있는 것으로 알려져 있습니다. 그 결과, (Δ = 162 Da)의 [M + K]+ 부가물로 표시되는 헥소스 올리고머의 피크가 확인되었습니다. 따라서, 이전에 E. oleracea 씨를 위해 맞춤형으로 개발된 표본 준비 의정서는, 또한 2개의 다른 단단한 야자 씨의 MALDI-IMS 분석을 가능하게 했습니다. 요컨대, 이 방법은 식물 재료의 형태 해부학 및 생리학 연구, 특히 절단 저항성 샘플에 대한 귀중한 도구가 될 수 있습니다.
Introduction
매트릭스 보조 레이저 탈착/이온화 이미징 질량 분석법(MALDI-IMS)은 2차원 생체 분자 할당을 허용하고 이온화 가능한 화합물의 비표적 조사를 제공하며 특히 생물학적 샘플 1,2에서 공간 분포를 결정하는 강력한 방법입니다. 20년 동안 이 기술은 지질, 펩타이드, 탄수화물, 단백질, 기타 대사 산물 및 치료 약물과 같은 합성 분자의 동시 검출 및 식별을 가능하게 했습니다 3,4. MALDI-IMS는 생물학 표본의 적출, 정화, 별거, 레테르를 붙이고, 또는 얼룩이 지도록 하지 않고 조직 표본 표면에 있는 화학 분석을 촉진합니다. 그러나 성공적인 분석을 위해 이 기법의 중추적인 단계는 시료 전처리이며, 특히 식물 조직에서는 환경 순응으로 인해 광범위하고 복잡한 장기에 특화되고 변형된다5.
고유한 식물 조직 물리화학적 특성 때문에, MALDI-IMS 분석의 요구 사항에 적응하고 절편 준비 6,7 동안 조직의 원래 모양을 보존하기 위해 적응된 프로토콜이 필요합니다. 종자와 같은 비전통적 샘플의 경우, 확립된 프로토콜8은 이러한 조직이 단단한 세포벽과 낮은 수분 함량을 가지고 있기 때문에 적용할 수 없으며, 이는 쉽게 절편 단편화를 유발하고 화합물 비국소화(compound delocalization)9를 유발할 수 있다.
우리 연구 그룹은 분자 매핑에 대한 실험 데이터와 임대 가능한 açaí 펄프13의 생산 중에 다량으로 생성되는 부산물인 açaí(Euterpe oleracea Mart.) 종자10,11,12의 MALDI-IMS 분석을 위한 적응된 프로토콜을 발표했습니다. 이 아이디어는 아사이 종자에 있는 다양한 대사 산물의 현장 매핑을 위한 프로토콜을 개발하여 현재 상업적으로 연구되지 않고 있는 이 농업 폐기물의 가능한 용도를 제안하는 데 도움이 되는 것이었습니다. 그러나 açaí 종자의 내성으로 인해 MALDI-IMS 분석에서 적절한 샘플 절편을 얻기 위해 프로토콜을 맞춤화해야 했습니다.
이러한 맥락에서 경제적으로 중요한 açaí 펄프는 유사한 감각 특성을 가진 Euterpe 속 야자수에서 다른 과일의 상업화를 증가시키는 동기를 부여했습니다. açaí14,15의 대안으로 산업 규모로 생산된 두 개의 신흥 야자수 열매는 아마존 건조 지대에서 자라는 E. precatoria(açaí-do-amazonas로 알려짐)와 대서양 숲에서 전형적으로 자라는 E. edulis(juçara로 알려짐)입니다. 그럼에도 불구하고 açaí-do-amazonas와 juçara의 소비는 사용되지 않고 자세한 화학 성분에 대해 지금까지 연구되지 않은 저항성 및 먹을 수없는 종자의 동일한 축적으로 이어집니다.
따라서, 우리는 이전에 고안된 프로토콜이 MALDI-IMS에 의한 분자 매핑을 위한 E. precatoria 및 E. edulis 종자를 분석하기 위해 몇 가지 적응 없이 사용될 수 있음을 여기에서 설명하며, 이러한 자원의 구성 분석에 사용할 수 있고 잠재적인 생명 공학적 용도를 결정하는 데 도움이 될 수 있는 강력한 도구임을 입증합니다. 더욱, 여기에서 제공된 상세한 묘사는 MALDI-IMS 분석을 위한 저항하는 물자 준비에 있는 유사한 어려움을 가진 다른 사람을 도울 수 있습니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
식물은 특정 생화학적 기능을 위한 특수 조직으로 구성되어 있습니다. 따라서 MALDI-IMS용 시료 전처리 프로토콜은 시료가 고품질 신호 및 공간 분해능8을 위해 원래의 분석물 분포와 풍부함을 유지해야 하기 때문에 특정 물리화학적 특성을 가진 다양한 식물 조직에 따라 설계되어야 합니다.
MALDI-IMS 분석 전에 주요 고려 사항은 샘플을 적절하게 수집하고 저장?…
Açıklamalar
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 연구는 Serrapilheira Institute(Serra-1708-15009)와 Carlos Chagas Filho Foundation for Supporting Research in the State of Rio de Janeiro(FAPERJ-JCNE-SEI-260003/004754/2021)에서 자금을 지원했습니다. Serrapilheira Institute와 CNPq(National Council for Scientific and Technological Development)는 Felipe Lopes Brum 박사와 Gabriel R. Martins 박사(기관 역량 강화 프로그램/INT/MCTI)에게 장학금을 수여했습니다. CAPES(Coordination for the Improvement of Higher Education Personnel)는 Mr. Davi M. M. C. da Silva에게 석사 장학금을 수여한 것으로 인정받고 있습니다. Centro de Espectrometria de Massas de Biomoléculas (CEMBIO-UFRJ)는 MALDI-IMS 분석과 함께 제공되는 서비스로 인정 받았으며, Alan Menezes do Nascimento 및 Centro de Caracterização em Nanotecnologia para Materiais e Catálise (CENANO-INT)는 MCTI/SISNANO/INT-CENANO-CNPQ 보조금 Nº 442604/2019의 자금 지원을 받아 초등 조성 분석에 대해 감사를 표했습니다.
Materials
| 1 mL Gastight Syringe Model 1001 TLL, PTFE Luer Lock | Hamilton Company | 81320 | |
| 2,5-Dihydroxybenzoic acid | Sigma Aldrich Co, MO, USA | 149357 | |
| APCI needle | Bruker Daltonik, Bremen, Germany | 602193 | |
| AxiDraw V3 xy motion platform | Evil Mad Scientist, CA, USA | 2510 | |
| Carbon double-sided conductive tape | |||
| Compass Data Analysis software | creation of mass list | ||
| Compressed air | |||
| copper double-faced adhesive tape | 3M, USA | 1182-3/4"X18YD | |
| Cryostat CM 1860 UV | Leica Biosystems, Nussloch, Germany | ||
| Diamond Wafering Blade 15 HC | |||
| Everhart-Thornley detector | |||
| FlexImaging | Bruker Daltonik, Bremen, Germany | image acquisition | |
| FTMS Processing | Bruker Daltonik, Bremen, Germany | data calibration | |
| Gelatin from bovine skin | Sigma Aldrich Co, MO, USA | G9391 | |
| High Profile Microtome Blades Leica 818 | Leica Biosystems, Nussloch, Germany | 0358 38926 | |
| indium tin oxide coated glass slide | Bruker Daltonik, Bremen, Germany | 8237001 | |
| Inkscape | Inkscape Project c/o Software Freedom Conservancy, NY, USA | ||
| IsoMet 1000 precision cutter | Buehler, Illinois, USA | ||
| Methanol | J.T.Baker | 9093-03 | |
| Mili-Q water | 18.2 MΩ.cm | ||
| Oil vacuum pump | |||
| Optimal Cutting Temperature Compound | Fisher HealthCare, Texas, USA | 4585 | |
| Parafilm "M" Sealing Film | Amcor | HS234526B | |
| Quanta 450 FEG | FEI Co, Hillsboro, OR, USA | ||
| SCiLS Lab (Multi-vendor support) MS Software | Bruker Daltonik, Bremen, Germany | ||
| Software INCA Suite 4.14 V | Oxford Instruments, Ableton, UK | ||
| Solarix 7T | Bruker Daltonik, Bremen, Germany | ||
| Syringe pump | kdScientific, MA, USA | 78-9100K | |
| Trifluoroacetic acid | Sigma Aldrich Co, MO, USA | 302031 | |
| X-Max spectrometer | Oxford Instruments, Ableton, UK |
Referanslar
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