Özet

Ex Vivo Imaging multimodale basato su OCT di occhi di donatori umani per la ricerca sulla degenerazione maculare legata all'età

Published: May 26, 2023
doi:

Özet

I test di laboratorio possono sfruttare il valore prognostico dell’imaging multimodale basato sulla tomografia a coerenza ottica longitudinale (OCT) della degenerazione maculare legata all’età (AMD). Gli occhi dei donatori umani con e senza AMD vengono ripresi utilizzando OCT, colore, oftalmoscopia laser a scansione di riflettanza nel vicino infrarosso e autofluorescenza a due lunghezze d’onda di eccitazione prima del sezionamento dei tessuti.

Abstract

Una sequenza di progressione per la degenerazione maculare legata all’età (AMD) appresa dall’imaging clinico multimodale basato sulla tomografia a coerenza ottica (OCT) (MMI) potrebbe aggiungere valore prognostico ai risultati di laboratorio. In questo lavoro, OCT e MMI ex vivo sono stati applicati agli occhi di donatori umani prima del sezionamento del tessuto retinico. Gli occhi sono stati recuperati da donatori bianchi non diabetici di età compresa tra ≥80 anni, con un tempo di morte per conservazione (DtoP) di ≤6 ore. I globi sono stati recuperati in loco, incisi con un trephine di 18 mm per facilitare la rimozione della cornea e immersi in paraformaldeide tamponata al 4%. Le immagini del fondo oculare a colori sono state acquisite dopo la rimozione del segmento anteriore con un cannocchiale da dissezione e una fotocamera reflex utilizzando l’illuminazione trans, epi- e flash a tre ingrandimenti. I globi sono stati collocati in un buffer all’interno di una camera progettata su misura con una lente da 60 diottrie. Sono stati fotografati con dominio spettrale OCT (cubo di macula di 30°, spaziatura di 30 μm, media = 25), riflettanza nel vicino infrarosso, autofluorescenza a 488 nm e autofluorescenza a 787 nm. Gli occhi AMD hanno mostrato un cambiamento nell’epitelio pigmentato retinico (RPE), con depositi di drusen o drusenoidi sottoretinici (SDD), con o senza neovascolarizzazione e senza evidenza di altre cause. Tra giugno 2016 e settembre 2017 sono stati recuperati 94 occhi destri e 90 occhi sinistri (DtoP: 3,9 ± 1,0 ore). Dei 184 occhi, il 40,2% aveva AMD, inclusa la AMD intermedia precoce (22,8%), atrofica (7,6%) e neovascolare (9,8%) e il 39,7% aveva macule insignificanti. Drusen, SDD, focolai iperriflettenti, atrofia e cicatrici fibrovascolari sono stati identificati utilizzando OCT. Gli artefatti includevano opacizzazione tissutale, distacchi (bacillare, retinica, RPE, coroideale), cambiamento cistico foveale, un RPE ondulato e danni meccanici. Per guidare la criosezione, sono stati utilizzati volumi OCT per trovare i punti di riferimento della fovea e della testa del nervo ottico e patologie specifiche. I volumi ex vivo sono stati registrati con i volumi in vivo selezionando la funzione di riferimento per l’eye tracking. La visibilità ex vivo della patologia osservata in vivo dipende dalla qualità della conservazione. Entro 16 mesi, 75 occhi rapidi di donatori di DtoP in tutte le fasi dell’AMD sono stati recuperati e messi in scena utilizzando metodi clinici MMI.

Introduction

Quindici anni di gestione della degenerazione maculare legata all’età (AMD) neovascolare con terapia anti-VEGF sotto la guida della tomografia a coerenza ottica (OCT) hanno offerto nuove conoscenze sulla sequenza di progressione e sulla microarchitettura di questa causa prevalente di perdita della vista. Un riconoscimento chiave è che l’AMD è una malattia tridimensionale che coinvolge la retina neurosensoriale, l’epitelio pigmentato retinico (RPE) e la coroide. Come risultato dell’imaging OCT dei pazienti dello studio e degli occhi dei pazienti della clinica trattati, le caratteristiche della patologia oltre a quelle viste dalla fotografia del fondo oculare a colori, uno standard clinico per decenni, sono ora riconosciute. Questi includono neovascolarizzazione intraretinica (neovascolarizzazione maculare di tipo 31, precedentemente proliferazione angiomatosa), depositi drusenoidi sottoretinici (SDD, chiamati anche pseudodrusen reticolari)2, vie multiple del destino RPE3,4 e cellule di Müller intensamente gliotiche nell’atrofia 5,6.

Sistemi modello privi di macule (cellule e animali) ricreano alcune fette di questa complessa malattia 7,8,9. Un ulteriore successo nel migliorare l’onere dell’AMD potrebbe venire dalla scoperta e dall’esplorazione della patologia primaria negli occhi umani, dalla comprensione della composizione cellulare unica della macula, seguita dalla traduzione in sistemi modello. Questo rapporto ritrae una collaborazione trentennale tra un laboratorio di ricerca accademica e una banca degli occhi. Gli obiettivi dei metodi di caratterizzazione tissutale descritti nel presente documento sono duplici: 1) informare la tecnologia diagnostica in evoluzione dimostrando le basi dell’aspetto del fondo oculare e delle sorgenti di segnali di imaging con la microscopia e 2) classificare i campioni di AMD per tecniche di scoperta molecolare mirate (immunoistochimica) e non mirate (spettrometria di massa di imaging, IMS e trascrittomica spaziale) che preservano la fovea a solo cono e la para- e perifovea ricche di bastoncelli. Tali studi potrebbero accelerare la traduzione in OCT clinico, per il quale una sequenza di progressione e un follow-up longitudinale sono possibili attraverso l’eye-tracking. Questa tecnologia, progettata per monitorare gli effetti del trattamento, registra le scansioni da una visita clinica all’altra utilizzando vasi retinici. Collegare l’OCT tracciato oculmente ai risultati di laboratorio ottenuti con tecniche distruttive potrebbe fornire un nuovo livello di valore prognostico ai risultati molecolari.

Nel 1993, il laboratorio di ricerca ha catturato fotografie a colori del fondo oscuro postmortem sulla pellicola10. Questo sforzo è stato ispirato dalla superba fotomicroscopia e istologia della retina periferica umana di Foos e colleghi 11,12,13 e dalle estese correlazioni clinico-patologiche AMD di Sarks et al.14,15. A partire dal 2009, è stato adottato l’imaging multimodale ex vivo (MMI) ancorato sul dominio spettrale OCT. Questa transizione è stata ispirata dagli sforzi simili di altri 16,17 e soprattutto dalla consapevolezza che gran parte dell’ultrastruttura descritta dai Sark era disponibile in tre dimensioni, nel tempo, nella clinica 18,19. L’obiettivo era quello di acquisire occhi con macule attaccate in un lasso di tempo ragionevole per studi ben potenziati dei fenotipi a livello cellulare nella retina, RPE e coroide. L’intento era quello di andare oltre le statistiche “per occhio” a “per tipo di lesione”, uno standard influenzato dai concetti di “placca vulnerabile” della malattia cardiovascolare20,21.

Il protocollo in questo rapporto riflette l’esperienza con quasi 400 paia di occhi di donatori accesi in diversi flussi. Nel 2011-2014 è stato creato il sito Web Project MACULA di istopatologia AMD, che include spessori di strato e annotazioni da 142 campioni archiviati. Questi occhi sono stati conservati dal 1996 al 2012 in un fissativo glutaraldeide-paraformaldeide per istologia epossi-resina ad alta risoluzione e microscopia elettronica. Tutti i fundi erano stati fotografati a colori quando ricevuti e sono stati ripresi da OCT poco prima dell’istologia. Un supporto per gli occhi originariamente progettato per gli studi sul nervo ottico22 è stato utilizzato per ospitare un punzone tissutale a tutto spessore di 8 mm di diametro centrato sulla fovea. Le scansioni OCT B attraverso il centro foveale e un sito 2 mm superiore, corrispondente all’istologia agli stessi livelli, sono state caricate sul sito web, oltre a una fotografia del fondo oculare a colori. La scelta dei piani OCT è stata dettata dalla preminenza della patologia AMD sotto la fovea23 e dalla prominenza degli SDD in aree ricche di bastoncelli superiori alla fovea24,25.

A partire dal 2013, gli occhi ripresi con MMI ancorato all’OCT durante la vita erano disponibili per correlazioni clinicopatologiche dirette. La maggior parte (7 donatori su 10) ha coinvolto pazienti in uno studio di riferimento della retina (autore: K.B.F.), che ha offerto un registro di direttive avanzate per i pazienti interessati a donare i loro occhi dopo la morte per scopi di ricerca. Gli occhi sono stati recuperati e conservati dalla banca degli occhi locale, trasferiti al laboratorio e preparati allo stesso modo degli occhi del Progetto MACULA. I volumi OCT clinici pre-mortem sono stati letti senza soluzione di continuità in laboratorio, allineando così le caratteristiche patologiche osservate durante la vita con le caratteristiche osservate al microscopio26.

A partire dal 2014, la raccolta oculare prospettica è iniziata con lo screening per AMD in occhi di donatori senza anamnesi clinica ma conservati entro un limite di tempo definito (6 ore). A tale scopo, il supporto dell’occhio è stato modificato per ospitare un intero globo. Ciò ha ridotto la possibilità di distacco attorno ai bordi tagliati del punzone da 8 mm precedentemente utilizzato. Gli occhi sono stati conservati in paraformaldeide tamponata al 4% per l’immunoistochimica e trasferiti all’1% il giorno successivo per la conservazione a lungo termine. Nel 2016-2017 (pre-pandemia) sono stati recuperati 184 occhi di 90 donatori. Le statistiche e le immagini in questo report sono generate da questa serie. Durante l’era della pandemia (lockdown e conseguenze del 2020), le raccolte prospettiche per la trascrittomica e le collaborazioni IMS sono proseguite a un ritmo ridotto, utilizzando essenzialmente i metodi del 2014.

Sono disponibili altri metodi per la valutazione dell’occhio del donatore. Il Minnesota Grading System (MGS)27,28 si basa sul sistema clinico AREDS per la fotografia del fondo oculare a colori 29. I limiti di questo metodo includono la combinazione di AMD atrofica e neovascolare in uno stadio di “AMD tardiva”. Inoltre, l’MGS comporta la rimozione della retina neurosensoriale prima della foto-documentazione della coroide RPE. Questo passaggio rimuove gli SDD a vari gradi30,31 e rimuove la corrispondenza spaziale della retina esterna e del suo sistema di supporto. Pertanto, gli sforzi per collegare la domanda metabolica e la segnalazione dalla retina alla patologia nella RPE-coroide possono essere ostacolati. Il sistema Utah ha implementato MMI utilizzando la fotografia a colori ex vivo e l’OCT per classificare gli occhi destinati alla dissezione in regioni per l’estrazione di RNA e proteine32. Sebbene preferibile alle estrazioni a coppa oculare intera, l’area di 3 mm di diametro a più alto rischio di progressione AMD33,34 rappresenta solo il 25% di un punch centrato sulla fovea di 6 mm di diametro. Pertanto, le tecniche in grado di localizzare i risultati in riferimento alla fovea, come il sezionamento seriale per l’immunoistochimica, sono vantaggiose.

Protocol

Il comitato di revisione istituzionale dell’Università dell’Alabama a Birmingham ha approvato gli studi di laboratorio, che hanno aderito alle buone pratiche di laboratorio e al livello di biosicurezza 2/2+. Tutte le banche degli occhi degli Stati Uniti sono conformi all’Uniform Anatomical Gifts Act del 2006 e alla Food and Drug Administration degli Stati Uniti. La maggior parte delle banche degli occhi statunitensi, tra cui Advancing Sight Network, sono conformi agli standard medici della Eye Bank Association of Americ…

Representative Results

La tabella 1 mostra che durante il 2016-2017 sono stati recuperati 184 occhi di 94 donatori bianchi non diabetici di età >80 anni. Il tempo medio di morte alla conservazione è stato di 3,9 ore (intervallo: 2,0-6,4 ore). Dei 184 occhi esaminati, 75 (40,2%) avevano una certa AMD. Sono state identificate le seguenti categorie: Insignificante (39,7%), Discutibile (11,4%), AMD precoce-intermedia (22,8%), Atrofica (7,6%), Neovascolare (9,8%), Altro (8,7%) e Sconosciuta/Non registrata/Non graduabile (<1%). <s…

Discussion

Utilizzando un approccio di screening basato sulla popolazione durante un periodo di 16 mesi nell’era pre-COVID, è stato possibile procurarsi 75 occhi di donatori con AMD. Tutti sono stati recuperati con un breve DtoP e messi in scena utilizzando MMI ancorato OCT. Il criterio di età (>80 anni) è al di fuori della fascia di età tipica per i recuperi di tessuto destinati a cornee trapiantabili. Nonostante l’età avanzata, i nostri criteri hanno portato gli occhi in tutte le fasi di AMD. Molti fenotipi RPE sono comuni a…

Açıklamalar

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Ringraziamo Heidelberg Engineering per la strumentazione e il design del titolare oculare originale, Richard F. Spaide MD per l’introduzione all’imaging multimodale basato su OCT, Christopher Girkin MD per aver facilitato l’accesso ai dispositivi di imaging clinico e David Fisher per la Figura 1. Il recupero degli occhi dei donatori umani per la ricerca è stato sostenuto dalle sovvenzioni del National Institutes of Health (NIH) R01EY06019 (C.A.C.), P30 EY003039 (Pittler), R01EY015520 (Smith) R01EY027948 (C.A.C., T.A.) R01EY030192 (Li), R01EY031209 (Stambolian) e U54EY032442 (Spraggins), IZKF Würzburg (N-304, T.A.), EyeSight Foundation of Alabama, International Retinal Research Foundation (C.A.C.), Arnold and Mabel Beckman Initiative for Macular Research (C.A.C.) e Research to Prevent Blindness AMD Catalyst (Schey).

Materials

Beakers, 250 mL Fisher # 02-540K
Bottles, 1 L, Pyrex  Fisher # 10-462-719 storage for preservative
Bunsen burner or heat source Eisco # 17-12-818 To melt wax
Camera, digital Nikon D7200 D7200
Computer and storage Apple iMac Pro; 14 TB external hard drive Image storage
Container, insulated Fisher # 02-591-45 For wet ice
Containers, 2 per donor, 40 mL Fisher Sameco Bio-Tite  40 mL # 13-711-86 For preservative
Crucible, quartz 30 mL Fisher # 08-072D Hold globe for photography
Cylinder, graduate, 250 mL Fisher # 08-549G
Disinfectant cleaning supplies   https://www.cardinalhealth.com/en/product-solutions/medical/infection-control/antiseptics.html
Eye holder with lens and mounting bracket contact J. Messinger jeffreymessinger@uabmc.edu custom modification of Heidelberg Engineering original design
Face Protection Masks Fisher # 19-910-667
Forceps, Harmon Fix Roboz  # RS-8247
Forceps, Micro Adson Roboz  # RS-5232
Forceps, Tissue Roboz # RS-5172
Glass petri dish, Kimax Fisher # 23064
Gloves Diamond Grip Fisher # MF-300
Gowns GenPro Fisher # 19-166-116
Image editing software Adobe Photoshop 2021, Creative Suite
KimWipes Fisher # 06-666
Lamps, 3 goosenecks Schott Imaging # A20800
Microscope, stereo Nikon SMZ 1000 for dissection
Microscope, stereo Olympus  SZX9 color fundus photography
Paraformaldehyde, 20%  EMS # 15713-S for preservative; dilute for storage
pH meter Fisher  # 01-913-806
Phosphate buffer, Sorenson’s, 0.2 M pH 7.2  EMS # 11600-10
Ring flash B & H Photo Video Sigma EM-140 DG 
Ruby bead, 1 mm diameter Meller Optics # MRB10MD
Safety Glasses 3M Fisher # 19-070-940
Scanning laser ophthalmoscope Heidelberg Engineering HRA2
Scissors, curved spring Roboz # RS-5681
Sharps container Fisher # 1482763
Shutter cord, remote Nikon MC-DC2
Spectral Domain OCT device Heidelberg Engineering Spectralis HRA&OCT https://www.heidelbergengineering.com/media/e-learning/Totara-US/files/pdf-tutorials/2238-003_Spectralis-Training-Guide.pdf
Stainless steel ball bearing, 25.4 mm diameter McMaster-Carr # 9529K31
Tissue marking dye, black Cancer Diagnostics Inc # 0727-1
Tissue slicer blades Thomas Scientific # 6767C18
Trephine, 18-mm diameter Stratis Healthcare # 6718L
TV monitor (HDMI) and cord for digital camera B&H Photo Video BH # COHD18G6PROB for live viewing and remote camera display features
Wax, pink dental EMS  # 72670
Wooden applicators Puritan # 807-12

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Bu Makaleden Alıntı Yapın
Messinger, J. D., Brinkmann, M., Kimble, J. A., Berlin, A., Freund, K. B., Grossman, G. H., Ach, T., Curcio, C. A. Ex Vivo OCT-Based Multimodal Imaging of Human Donor Eyes for Research into Age-Related Macular Degeneration. J. Vis. Exp. (195), e65240, doi:10.3791/65240 (2023).

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