Özet

Determinación de cinética de encendido in vitro y celular para aptámeros de ARN fluorogénicos

Published: August 09, 2022
doi:

Özet

El protocolo presenta dos métodos para determinar la cinética de los aptámeros de ARN fluorogénico Spinach2 y Brócoli. El primer método describe cómo medir la cinética del aptámero fluorogénico in vitro con un lector de placas, mientras que el segundo método detalla la medición de la cinética del aptámero fluorogénico en las células mediante citometría de flujo.

Abstract

Los aptámeros de ARN fluorogénico se han aplicado en células vivas para etiquetar y visualizar ARN, informar sobre la expresión génica y activar biosensores fluorescentes que detectan niveles de metabolitos y moléculas de señalización. Para estudiar los cambios dinámicos en cada uno de estos sistemas, es deseable obtener mediciones en tiempo real, pero la precisión de las mediciones depende de que la cinética de la reacción fluorogénica sea más rápida que la frecuencia de muestreo. Aquí, describimos métodos para determinar la cinética de encendido in vitro y celular para aptámeros de ARN fluorogénicos utilizando un lector de placas equipado con un inyector de muestras y un citómetro de flujo, respectivamente. Mostramos que la cinética in vitro para la activación de fluorescencia de los aptámeros de espinaca2 y brócoli se puede modelar como reacciones de asociación de dos fases y tienen diferentes constantes de velocidad de fase rápida de 0.56 s−1 y 0.35 s−1, respectivamente. Además, mostramos que la cinética celular para la activación de fluorescencia de la espinaca2 en Escherichia coli, que está aún más limitada por la difusión del colorante en las bacterias gramnegativas, sigue siendo lo suficientemente rápida como para permitir una frecuencia de muestreo precisa en la escala de tiempo diminuta. Estos métodos para analizar la cinética de activación de fluorescencia son aplicables a otros aptámeros de ARN fluorogénicos que se han desarrollado.

Introduction

Las reacciones fluorogénicas son reacciones químicas que generan una señal de fluorescencia. Los aptámeros de ARN fluorogénico suelen realizar esta función uniendo un colorante de molécula pequeña para mejorar su rendimiento cuántico de fluorescencia (Figura 1A)1. Se han desarrollado diferentes sistemas de aptámeros de ARN fluorogénicos que consisten en secuencias específicas de aptámeros de ARN y los correspondientes ligandos de colorante1. Los aptámeros de ARN fluorogénicos se han añadido a las transcripciones de ARN como etiquetas fluorescentes que permiten obtener imágenes de células vivas de ARNm y ARN no codificantes 2,3,4. También se han colocado después de secuencias promotoras como reporteros fluorescentes de expresión génica, similar al uso de proteína fluorescente verde (GFP) como reportero, excepto que la función de informe está en el nivel de ARN 5,6. Finalmente, los aptámeros de ARN fluorogénico se han incorporado a biosensores fluorescentes basados en ARN, que están diseñados para desencadenar la reacción fluorogénica en respuesta a una molécula pequeña específica. Se han desarrollado biosensores fluorescentes basados en ARN para obtener imágenes de células vivas de varios metabolitos no fluorescentes y moléculas de señalización 7,8,9,10,11.

Existe un creciente interés en el desarrollo de aptámeros de ARN fluorogénicos para visualizar cambios dinámicos en la localización del ARN, la expresión génica y las señales de moléculas pequeñas. Para cada una de estas aplicaciones, es deseable obtener mediciones en tiempo real, pero la precisión de las mediciones depende de que la cinética de la reacción fluorogénica sea más rápida que la frecuencia de muestreo. Aquí, describimos métodos para determinar la cinética in vitro para los aptámeros de ARN fluorogénicos Spinach212 y Brócoli13 utilizando un lector de placas equipado con un inyector de muestras y para determinar la cinética de activación celular para Spinach2 expresada en Escherichia coli utilizando un citómetro de flujo. Estos dos aptámeros de ARN fueron elegidos porque se han aplicado para estudiar la localización de ARN 2,3,4, se han utilizado en reporteros5,6 y biosensores 7,8,9,10,11, y los ligandos de colorante correspondientes (DFHBI o DFHBI-1T) están disponibles comercialmente. Un resumen de sus propiedades in vitro determinadas en la literatura se da en la Tabla 1 4,13,14, que informó el desarrollo del protocolo (por ejemplo, las longitudes de onda y las concentraciones de colorantes utilizadas). Estos resultados demuestran que las reacciones fluorogénicas afectadas por los aptámeros de ARN son rápidas y no deben impedir mediciones precisas para las aplicaciones biológicas celulares deseadas.

Protocol

1. Experimento cinético in vitro Preparación de plantillas de ADN por PCRConfigure la(s) reacción(es) de PCR: Para preparar reacciones de PCR, combine los siguientes reactivos en un tubo de PCR de pared delgada:33 μL de agua de doble destilación (ddH2O)10 μL de tampón 5x para ADN polimerasa de alta fidelidad5 μL de 2 mM de cada desoxirribonucleósido trifosfato (dNTP)0,5 μL de cebador directo de 40 μM0,5 μL de cebador inverso de 40 μM<…

Representative Results

Cinética in vitro Las secuencias de los moldes y cebadores de ADN, que se compran como oligonucleótidos sintéticos, se muestran en la Tabla 2, y las recetas de reactivos se muestran en el Archivo Suplementario 1. La amplificación por PCR se utiliza para aumentar la cantidad de plantilla de ADN con el promotor T7, que se requiere para la posterior reacción de transcripción in vitro (IVT). Además, la amplificación por PCR se p…

Discussion

Para el experimento de cinética in vitro , se puede modificar el mismo protocolo general para medir la cinética in vitro de un biosensor fluorescente basado en ARN que contiene un dominio de unión a ligando y de unión a fluoróforos8. En este caso, el ARN debe incubarse con el fluoróforo antes de las mediciones al inyectar el ligando para obtener la cinética de respuesta del ligando. Si se observa una alta variabilidad entre las réplicas, se puede solucionar el problema ve…

Açıklamalar

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Este trabajo fue apoyado por las siguientes subvenciones a MCH: NSF-BSF 1815508 y NIH R01 GM124589. MRM fue parcialmente apoyado por la subvención de capacitación NIH T32 GM122740.

Materials

Agarose Thermo Fischer Scientific BP160500
Agarose gel electrophoresis equipment Thermo Fischer Scientific B1A-BP
Alpha D-(+)-lactose monohydrate Thermo Fischer Scientific 18-600-440
Amber 1.5 mL microcentrifuge tubes Thermo Fischer Scientific 22431021
Ammonium persulfate (APS) Sigma-Aldrich A3678
Ammonium sulfate ((NH4)2SO4) Sigma-Aldrich A4418
Attune NxT Flow cytometer Thermo Fischer Scientific A24861
Attune 1x Focusing Fluid Thermo Fischer Scientific A24904
Attune Shutdown Solution Thermo Fischer Scientific A24975
Attune Performance Tracking Beads Thermo Fischer Scientific 4449754
Attune Wash Solution Thermo Fischer Scientific  J24974
Boric acid Sigma-Aldrich B6768
Bromophenol blue Sigma-Aldrich B0126
Carbenicillin disodium salt Sigma-Aldrich C3416
Chlorine Bleach Amazon B07J6FJR8D
Corning Costar 96-well plate Daigger Scientific EF86610A
Culture Tubes, 12 mm x 75 mm, 5 mL with attached dual position cap Globe Scientific 05-402-31
DFHBI Sigma-Aldrich SML1627
DFHBI-1T Sigma-Aldrich SML2697
D-Glucose (anhydrous) Acros Organics AC410955000
Dimethyl sulfoxide (DMSO) Sigma-Aldrich D8418
Dithiothreitol (DTT) Sigma-Aldrich DTT-RO
DNA loading dye New England Biolabs B7025S
DNA LoBind Tubes (2.0 mL) Eppendorf 22431048
dNTPs: dATP, dCTP, dGTP, dTTP New England Biolabs N0446S
EDTA, pH 8.0 Gibco, Life Technologies AM9260G
Ethanol (EtOH) Sigma-Aldrich E7023
Filter-tip micropipettor tips Thermo Fischer Scientific AM12635, AM12648, AM12655, AM12665
FlowJo Software BD Biosciences N/A FlowJo v10 Software
Fluorescent plate reader with heating control VWR 10014-924
Gel electrophoresis power supply Thermo Fischer Scientific EC3000XL2
Glycerol Sigma-Aldrich G5516
Glycogen AM95010 Thermo Fischer Scientific AM95010
GraphPad Prism Dotmatics N/A Analysis software from Academic Group License 
Heat block  Thomas Scientific 1159Z11
HEPES Sigma-Aldrich H-4034
Inorganic pyrophosphatase Sigma-Aldrich I1643-500UN
Low Molecular Weight DNA Ladder New England Biolabs N3233L Supplied with free vial of Gel Loading Dye, Purple (6x), no SDS (NEB #B7025).
Magnesium chloride hexahydrate (MgCl2) Sigma-Aldrich M2670
Magnesium sulfate (MgSO4) Fisher Scientific MFCD00011110
Microcentrifuge tubes (1.5 mL) Eppendorf 22363204
Microcentrifuge with temperature control Marshall Scientific EP-5415R
Micropipettors Gilson FA10001M, FA10003M, FA10005M, FA10006M
Micropipettor tips Sigma-Aldrich Z369004, AXYT200CR, AXYT1000CR
Millipore water filter with BioPak unit Sigma-Aldrich CDUFBI001, ZRQSVR3WW
Narrow micropipettor pipette tips DOT Scientific RN005R-LRS
PBS, 10x Thermo Fischer Scientific BP39920
PCR clean-up kit Qiagen 28181
PCR primers and templates Integrated DNA technologies
PCR thermocycler for thin-walled PCR tubes Bio-Rad 1851148
PCR thermocycler for 0.5 mL tubes Techne 5PRIME/C
pET31b-T7-Spinach2 Plasmid Addgene Plasmid #79783
Phusion High-Fidelity DNA polymerase  New England Biolabs M0530L Purchase of Phusion High-Fideldity Enzyme is supplied with 5x Phusion HF Buffer, 5x Phusion GC Buffer, and MgCl2 and DMSO solutions.
Polyacrylamide gel electrophoresis gel comb, C.B.S. Scientific C.B.S. Scientific VGC-1508
Polyacrylamide gel electrophoresis equipment C.B.S. Scientific ASG-250
Potassium chloride (KCl) Sigma-Aldrich P9333
Potassium phosphate monobasic Sigma-Aldrich P5655
Razor blades Genesee Scientific 38-101
rNTPs: ATP, CTP, GTP, UTP New England Biolabs N0450L
SDS Sigma-Aldrich L3771
Short wave UV light source Thermo Fischer Scientific 11758221
Sodium carbonate (Na2CO3) Sigma-Aldrich S7795
Sodium chloride (NaCl) Sigma-Aldrich S7653
Sodium hydroxide (NaOH) Sigma-Aldrich S8045
Sodium phosphate dibasic, anhydrous Thermo Fischer Scientific S375-500
SoftMax Pro Molecular Devices N/A SoftMax Pro 6.5.1 (platereader software) obtained through Academic Group License
Sterile filter units Thermo Fischer Scientific 09-741-88
Sucrose Sigma-Aldrich S0389
SYBR Safe DNA gel stain Thermo Fischer Scientific S33102
TAE buffer for agarose gel electrophoresis Thermo Fischer Scientific AM9869
Tetramethylethylenediamine (TEMED) Sigma-Aldrich T9281
Tris base Sigma-Aldrich TRIS-RO
Tryptone (granulated) Thermo Fischer Scientific M0251S
T7 RNA polymerase New England Biolabs M0251S
Urea-PAGE Gel system  National Diagnostics EC-833
UV fluorescent TLC plate Sigma-Aldrich 1.05789.0001
UV/Vis spectrophotometer Thermo Fischer Scientific ND-8000-GL
Vortex mixer Thermo Fischer Scientific 2215415
Xylene cyanol Sigma-Aldrich X4126
Yeast Extract (Granulated) Thermo Fischer Scientific BP9727-2

Referanslar

  1. Su, Y., Hammond, M. C. RNA-based fluorescent biosensors for live cell imaging of small molecules and RNAs. Current Opinion in Biotechnology. 63, 157-166 (2020).
  2. Zhang, J., et al. Tandem spinach array for mRNA Imaging in living bacterial cells. Scientific Reports. 5, 17295 (2015).
  3. Wang, Z., et al. In spatial complementation of aptamer-mediated recognition enables live-cell imaging of native RNA transcripts in real time. Angewandte Chemie. 57 (4), 972-976 (2018).
  4. Strack, R. L., Disney, M. D., Jaffrey, S. R. A superfolding Spinach2 reveals the dynamic nature of trinucleotide repeat-containing RNA. Nature Methods. 10 (12), 1219-1224 (2013).
  5. Thavarajah, W., et al. Point-of-use detection of environmental fluoride via a cell-free riboswitch-based biosensor. ACS Synthetic Biology. 9 (1), 10-18 (2020).
  6. You, M., Litke, J. L., Jaffrey, S. R. Imaging metabolite dynamics in living cells using a Spinach-based riboswitch. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (21), 2756-2765 (2015).
  7. Kellenberger, C. A., Wilson, S. C., Sales-Lee, J., Hammond, M. C. RNA-based fluorescent biosensors for live cell imaging of second messengers cyclic di-GMP and cyclic AMP-GMP. Journal of the American Chemical Society. 135 (13), 4906-4909 (2013).
  8. Manna, S., Truong, J., Hammond, M. C. Guanidine biosensors enable comparison of cellular turn-on kinetics of riboswitch-based biosensor and reporter. ACS Synthetic Biology. 10 (3), 566-578 (2021).
  9. Bose, D., Su, Y., Marcus, A., Raulet, D. H., Hammond, M. C. An RNA-based fluorescent biosensor for high-throughput analysis of the cGAS-cGAMP-STING pathway. Cell Chemical Biology. 23 (12), 1539-1549 (2016).
  10. Wang, X. C., Wilson, S. C., Hammond, M. C. Next-generation RNA-based fluorescent biosensors enable anaerobic detection of cyclic di-GMP. Nucleic Acids Research. 44 (17), 139 (2016).
  11. Paige, J. S., Thinh, N. -. D., Wenjiao, S., Jaffrey, S. R. Fluorescence imaging of cellular metabolites with RNA. Science. 335 (6073), 1194 (2012).
  12. Paige, J. S., Wu, K. Y., Jaffrey, S. R. RNA mimics of green fluorescent protein. Science. 333 (6042), 642-646 (2011).
  13. Filonov, G. S., Moon, J. D., Svensen, N., Jaffrey, S. R. Broccoli: Rapid selection of an RNA mimic of green fluorescent protein by fluorescence-based selection and directed evolution. Journal of the American Chemical Society. 136 (46), 16299-16308 (2014).
  14. Song, W., Strack, R. L., Svensen, N., Jaffrey, S. R. Plug-and-play fluorophores extend the spectral properties of spinach. Journal of the American Chemical Society. 136 (4), 1198-1201 (2014).
  15. Sambrook, J., Fritsch, E., Maniatis, T. . Molecular Cloning: A Laboratory Manual. , (1989).
  16. Basch, H., Gadebusch, H. H. In vitro antimicrobial activity of dimethylsulfoxide. Applied Microbiology. 16 (12), 1953-1954 (1968).
  17. Kallansrud, G., Ward, B. A comparison of measured and calculated single- and double-stranded oligodeoxynucleotide extinction coefficients. Analytical Biochemistry. 236 (1), 134-138 (1996).
  18. Wilson, S. C., Cohen, D. T., Wang, X. C., Hammond, M. C. A neutral pH thermal hydrolysis method for quantification of structured RNAs. RNA. 20 (7), 1153-1160 (2014).
  19. Szatmári, D., et al. Intracellular ion concentrations and cation-dependent remodelling of bacterial MreB assemblies. Scientific Reports. 10, 12002 (2020).
  20. Boulos, L., Prévost, M., Barbeau, B., Coallier, J., Desjardins, R. LIVE/DEAD® BacLightTM: Application of a new rapid staining method for direct enumeration of viable and total bacteria in drinking water. Journal of Microbiological Methods. 37 (1), 77-86 (1999).
  21. Huang, H., et al. A G-quadruplex-containing RNA activates fluorescence in a GFP-like fluorophore. Nature Chemical Biology. 10 (8), 686-691 (2014).
  22. Jeng, S. C. Y., Chan, H. H. Y., Booy, E. P., McKenna, S. A., Unrau, P. J. Fluorophore ligand binding and complex stabilization of the RNA Mango and RNA Spinach aptamers. RNA. 22 (12), 1884-1892 (2016).
  23. Han, K. Y., Leslie, B. J., Fei, J., Zhang, J., Ha, T. Understanding the photophysics of the Spinach-DFHBI RNA aptamer-fluorogen complex to improve live-cell RNA imaging. Journal of the American Chemical Society. 135 (50), 19033-19038 (2013).
  24. Wang, P., et al. Photochemical properties of Spinach and its use in selective imaging. Chemical Science. 4 (7), 2865-2873 (2013).
  25. Dao, N. T., et al. Photophysics of DFHBI bound to RNA aptamer Baby Spinach. Scientific Reports. 11, 7356 (2021).

Play Video

Bu Makaleden Alıntı Yapın
Mumbleau, M. M., Meyer, M. R., Hammond, M. C. Determination of In Vitro and Cellular Turn-on Kinetics for Fluorogenic RNA Aptamers. J. Vis. Exp. (186), e64367, doi:10.3791/64367 (2022).

View Video