Özet

Bestimmung der in vitro und zellulären Einschaltkinetik für fluorogene RNA-Aptamere

Published: August 09, 2022
doi:

Özet

Das Protokoll stellt zwei Methoden vor, um die Kinetik der fluorogenen RNA-Aptamere Spinat2 und Brokkoli zu bestimmen. Die erste Methode beschreibt, wie die fluorogene Aptamerkinetik in vitro mit einem Plattenleser gemessen werden kann, während die zweite Methode die Messung der fluorogenen Aptamerkinetik videodan Zellen durch Durchflusszytometrie beschreibt.

Abstract

Fluorogene RNA-Aptamere wurden in lebenden Zellen eingesetzt, um RNAs zu markieren und sichtbar zu machen, über die Genexpression zu berichten und fluoreszierende Biosensoren zu aktivieren, die Konzentrationen von Metaboliten und Signalmolekülen erkennen. Um dynamische Änderungen in jedem dieser Systeme zu untersuchen, ist es wünschenswert, Echtzeitmessungen zu erhalten, aber die Genauigkeit der Messungen hängt davon ab, ob die Kinetik der fluorogenen Reaktion schneller ist als die Probenahmefrequenz. Hier beschreiben wir Methoden zur Bestimmung der in vitro und zellulären Einschaltkinetik für fluorogene RNA-Aptamere mit einem Plattenleser, der mit einem Probeninjektor bzw. einem Durchflusszytometer ausgestattet ist. Wir zeigen, dass die in vitro Kinetik für die Fluoreszenzaktivierung der Spinat2- und Brokkoli-Aptamere als zweiphasige Assoziationsreaktionen modelliert werden kann und unterschiedliche schnelle Phasenratenkonstanten von 0,56 s−1 bzw. 0,35 s−1 aufweist. Darüber hinaus zeigen wir, dass die zelluläre Kinetik für die Fluoreszenzaktivierung von Spinat2 in Escherichia coli, die durch die Farbstoffdiffusion in die gramnegativen Bakterien weiter begrenzt wird, immer noch schnell genug ist, um eine genaue Probenhäufigkeit auf der Minutenskala zu ermöglichen. Diese Methoden zur Analyse der Fluoreszenzaktivierungskinetik sind auf andere fluorogene RNA-Aptamere anwendbar, die entwickelt wurden.

Introduction

Fluorogene Reaktionen sind chemische Reaktionen, die ein Fluoreszenzsignal erzeugen. Fluorogene RNA-Aptamere erfüllen diese Funktion typischerweise, indem sie einen kleinmolekularen Farbstoff binden, um seine Fluoreszenzquantenausbeute zu erhöhen (Abbildung 1A)1. Verschiedene fluorogene RNA-Aptamersysteme wurden entwickelt und bestehen aus spezifischen RNA-Aptamersequenzen und den entsprechenden Farbstoffliganden1. Fluorogene RNA-Aptamere wurden an RNA-Transkripte als fluoreszierende Tags angehängt, die die Bildgebung lebender Zellen von mRNAs und nicht-kodierenden RNAsermöglichen 2,3,4. Sie wurden auch nach Promotorsequenzen als fluoreszierende Reporter der Genexpression platziert, ähnlich der Verwendung von grün fluoreszierendem Protein (GFP) als Reporter, außer dass die Berichtsfunktion auf der RNA-Ebene 5,6 liegt. Schließlich wurden fluorogene RNA-Aptamere in RNA-basierte fluoreszierende Biosensoren eingebaut, die die fluorogene Reaktion als Reaktion auf ein bestimmtes kleines Molekül auslösen sollen. RNA-basierte fluoreszierende Biosensoren wurden für die Lebendzellbildgebung verschiedener nicht-fluoreszierender Metaboliten und Signalmoleküle 7,8,9,10,11 entwickelt.

Es besteht ein wachsendes Interesse an der Entwicklung fluorogener RNA-Aptamere zur Visualisierung dynamischer Veränderungen der RNA-Lokalisierung, der Genexpression und der niedermolekularen Signale. Für jede dieser Anwendungen ist es wünschenswert, Echtzeitmessungen zu erhalten, aber die Genauigkeit der Messungen hängt davon ab, ob die Kinetik der fluorogenen Reaktion schneller ist als die Probenahmefrequenz. Hier beschreiben wir Methoden zur Bestimmung der in vitro Kinetik für fluorogene RNA-Aptamere Spinat212 und Brokkoli13 mit einem mit einem Probeninjektor ausgestatteten Plattenleser und zur Bestimmung der zellulären Einschaltkinetik für Spinat2 exprimiert in Escherichia coli mittels Durchflusszytometer. Diese beiden RNA-Aptamere wurden ausgewählt, weil sie zur Untersuchung der RNA-Lokalisierung 2,3,4 eingesetzt wurden, sie wurden in den Reportern5,6 und Biosensoren 7,8,9,10,11 verwendet und die entsprechenden Farbstoffliganden (DFHBI oder DFHBI-1T) sind kommerziell erhältlich. Eine Zusammenfassung ihrer in der Literatur ermittelten In-vitro-Eigenschaften ist in Tabelle 1 4,13,14 enthalten, die in die Entwicklung des Protokolls einflossen (z. B. die verwendeten Wellenlängen und Farbstoffkonzentrationen). Diese Ergebnisse zeigen, dass die fluorogenen Reaktionen, die von RNA-Aptameren beeinflusst werden, schnell sind und genaue Messungen für die gewünschten zellbiologischen Anwendungen nicht behindern sollten.

Protocol

1. In-vitro-Kinetik-Experiment Herstellung von DNA-Templates mittels PCRPCR-Reaktion(en) einrichten: Zur Vorbereitung von PCR-Reaktionen kombinieren Sie die folgenden Reagenzien in einem dünnwandigen PCR-Röhrchen:33 μL doppelt destilliertes Wasser (ddH2O)10 μL 5x Puffer für High-Fidelity-DNA-Polymerase5 μL je 2 mM Desoxyribonukleosidtriphosphat (dNTP)0,5 μL 40 μM Vorwärtsprimer0,5 μL 40 μM Reverse-Primer0,5 μL (10-100 ng) DNA-Vorl…

Representative Results

In-vitro-Kinetik Die Sequenzen der DNA-Vorlagen und Primer, die als synthetische Oligonukleotide gekauft werden, sind in Tabelle 2 und die Reagenzienrezepte in der Zusatzdatei 1 aufgeführt. Die PCR-Amplifikation wird verwendet, um die Menge der DNA-Vorlage mit dem T7-Promotor zu erhöhen, die für die nachfolgende In-vitro-Transkriptionsreaktion (IVT) erforderlich ist. Darüber hinaus kann die PCR-Amplifikation für zwei Zwecke in…

Discussion

Für das In-vitro-Kinetik-Experiment kann das gleiche allgemeine Protokoll modifiziert werden, um die In-vitro-Kinetik eines RNA-basierten fluoreszierenden Biosensors zu messen, der sowohl eine ligandenbindende als auch eine fluorophorbindende Domäne8 enthält. In diesem Fall sollte die RNA vor Messungen nach Injektion des Liganden mit dem Fluorophor inkubiert werden, um eine Ligandenantwortkinetik zu erhalten. Wenn eine hohe Variabilität zwischen den Replikaten beobachtet wir…

Açıklamalar

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Diese Arbeit wurde durch die folgenden Zuschüsse an MCH unterstützt: NSF-BSF 1815508 und NIH R01 GM124589. MRM wurde teilweise durch das Ausbildungsstipendium NIH T32 GM122740 unterstützt.

Materials

Agarose Thermo Fischer Scientific BP160500
Agarose gel electrophoresis equipment Thermo Fischer Scientific B1A-BP
Alpha D-(+)-lactose monohydrate Thermo Fischer Scientific 18-600-440
Amber 1.5 mL microcentrifuge tubes Thermo Fischer Scientific 22431021
Ammonium persulfate (APS) Sigma-Aldrich A3678
Ammonium sulfate ((NH4)2SO4) Sigma-Aldrich A4418
Attune NxT Flow cytometer Thermo Fischer Scientific A24861
Attune 1x Focusing Fluid Thermo Fischer Scientific A24904
Attune Shutdown Solution Thermo Fischer Scientific A24975
Attune Performance Tracking Beads Thermo Fischer Scientific 4449754
Attune Wash Solution Thermo Fischer Scientific  J24974
Boric acid Sigma-Aldrich B6768
Bromophenol blue Sigma-Aldrich B0126
Carbenicillin disodium salt Sigma-Aldrich C3416
Chlorine Bleach Amazon B07J6FJR8D
Corning Costar 96-well plate Daigger Scientific EF86610A
Culture Tubes, 12 mm x 75 mm, 5 mL with attached dual position cap Globe Scientific 05-402-31
DFHBI Sigma-Aldrich SML1627
DFHBI-1T Sigma-Aldrich SML2697
D-Glucose (anhydrous) Acros Organics AC410955000
Dimethyl sulfoxide (DMSO) Sigma-Aldrich D8418
Dithiothreitol (DTT) Sigma-Aldrich DTT-RO
DNA loading dye New England Biolabs B7025S
DNA LoBind Tubes (2.0 mL) Eppendorf 22431048
dNTPs: dATP, dCTP, dGTP, dTTP New England Biolabs N0446S
EDTA, pH 8.0 Gibco, Life Technologies AM9260G
Ethanol (EtOH) Sigma-Aldrich E7023
Filter-tip micropipettor tips Thermo Fischer Scientific AM12635, AM12648, AM12655, AM12665
FlowJo Software BD Biosciences N/A FlowJo v10 Software
Fluorescent plate reader with heating control VWR 10014-924
Gel electrophoresis power supply Thermo Fischer Scientific EC3000XL2
Glycerol Sigma-Aldrich G5516
Glycogen AM95010 Thermo Fischer Scientific AM95010
GraphPad Prism Dotmatics N/A Analysis software from Academic Group License 
Heat block  Thomas Scientific 1159Z11
HEPES Sigma-Aldrich H-4034
Inorganic pyrophosphatase Sigma-Aldrich I1643-500UN
Low Molecular Weight DNA Ladder New England Biolabs N3233L Supplied with free vial of Gel Loading Dye, Purple (6x), no SDS (NEB #B7025).
Magnesium chloride hexahydrate (MgCl2) Sigma-Aldrich M2670
Magnesium sulfate (MgSO4) Fisher Scientific MFCD00011110
Microcentrifuge tubes (1.5 mL) Eppendorf 22363204
Microcentrifuge with temperature control Marshall Scientific EP-5415R
Micropipettors Gilson FA10001M, FA10003M, FA10005M, FA10006M
Micropipettor tips Sigma-Aldrich Z369004, AXYT200CR, AXYT1000CR
Millipore water filter with BioPak unit Sigma-Aldrich CDUFBI001, ZRQSVR3WW
Narrow micropipettor pipette tips DOT Scientific RN005R-LRS
PBS, 10x Thermo Fischer Scientific BP39920
PCR clean-up kit Qiagen 28181
PCR primers and templates Integrated DNA technologies
PCR thermocycler for thin-walled PCR tubes Bio-Rad 1851148
PCR thermocycler for 0.5 mL tubes Techne 5PRIME/C
pET31b-T7-Spinach2 Plasmid Addgene Plasmid #79783
Phusion High-Fidelity DNA polymerase  New England Biolabs M0530L Purchase of Phusion High-Fideldity Enzyme is supplied with 5x Phusion HF Buffer, 5x Phusion GC Buffer, and MgCl2 and DMSO solutions.
Polyacrylamide gel electrophoresis gel comb, C.B.S. Scientific C.B.S. Scientific VGC-1508
Polyacrylamide gel electrophoresis equipment C.B.S. Scientific ASG-250
Potassium chloride (KCl) Sigma-Aldrich P9333
Potassium phosphate monobasic Sigma-Aldrich P5655
Razor blades Genesee Scientific 38-101
rNTPs: ATP, CTP, GTP, UTP New England Biolabs N0450L
SDS Sigma-Aldrich L3771
Short wave UV light source Thermo Fischer Scientific 11758221
Sodium carbonate (Na2CO3) Sigma-Aldrich S7795
Sodium chloride (NaCl) Sigma-Aldrich S7653
Sodium hydroxide (NaOH) Sigma-Aldrich S8045
Sodium phosphate dibasic, anhydrous Thermo Fischer Scientific S375-500
SoftMax Pro Molecular Devices N/A SoftMax Pro 6.5.1 (platereader software) obtained through Academic Group License
Sterile filter units Thermo Fischer Scientific 09-741-88
Sucrose Sigma-Aldrich S0389
SYBR Safe DNA gel stain Thermo Fischer Scientific S33102
TAE buffer for agarose gel electrophoresis Thermo Fischer Scientific AM9869
Tetramethylethylenediamine (TEMED) Sigma-Aldrich T9281
Tris base Sigma-Aldrich TRIS-RO
Tryptone (granulated) Thermo Fischer Scientific M0251S
T7 RNA polymerase New England Biolabs M0251S
Urea-PAGE Gel system  National Diagnostics EC-833
UV fluorescent TLC plate Sigma-Aldrich 1.05789.0001
UV/Vis spectrophotometer Thermo Fischer Scientific ND-8000-GL
Vortex mixer Thermo Fischer Scientific 2215415
Xylene cyanol Sigma-Aldrich X4126
Yeast Extract (Granulated) Thermo Fischer Scientific BP9727-2

Referanslar

  1. Su, Y., Hammond, M. C. RNA-based fluorescent biosensors for live cell imaging of small molecules and RNAs. Current Opinion in Biotechnology. 63, 157-166 (2020).
  2. Zhang, J., et al. Tandem spinach array for mRNA Imaging in living bacterial cells. Scientific Reports. 5, 17295 (2015).
  3. Wang, Z., et al. In spatial complementation of aptamer-mediated recognition enables live-cell imaging of native RNA transcripts in real time. Angewandte Chemie. 57 (4), 972-976 (2018).
  4. Strack, R. L., Disney, M. D., Jaffrey, S. R. A superfolding Spinach2 reveals the dynamic nature of trinucleotide repeat-containing RNA. Nature Methods. 10 (12), 1219-1224 (2013).
  5. Thavarajah, W., et al. Point-of-use detection of environmental fluoride via a cell-free riboswitch-based biosensor. ACS Synthetic Biology. 9 (1), 10-18 (2020).
  6. You, M., Litke, J. L., Jaffrey, S. R. Imaging metabolite dynamics in living cells using a Spinach-based riboswitch. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (21), 2756-2765 (2015).
  7. Kellenberger, C. A., Wilson, S. C., Sales-Lee, J., Hammond, M. C. RNA-based fluorescent biosensors for live cell imaging of second messengers cyclic di-GMP and cyclic AMP-GMP. Journal of the American Chemical Society. 135 (13), 4906-4909 (2013).
  8. Manna, S., Truong, J., Hammond, M. C. Guanidine biosensors enable comparison of cellular turn-on kinetics of riboswitch-based biosensor and reporter. ACS Synthetic Biology. 10 (3), 566-578 (2021).
  9. Bose, D., Su, Y., Marcus, A., Raulet, D. H., Hammond, M. C. An RNA-based fluorescent biosensor for high-throughput analysis of the cGAS-cGAMP-STING pathway. Cell Chemical Biology. 23 (12), 1539-1549 (2016).
  10. Wang, X. C., Wilson, S. C., Hammond, M. C. Next-generation RNA-based fluorescent biosensors enable anaerobic detection of cyclic di-GMP. Nucleic Acids Research. 44 (17), 139 (2016).
  11. Paige, J. S., Thinh, N. -. D., Wenjiao, S., Jaffrey, S. R. Fluorescence imaging of cellular metabolites with RNA. Science. 335 (6073), 1194 (2012).
  12. Paige, J. S., Wu, K. Y., Jaffrey, S. R. RNA mimics of green fluorescent protein. Science. 333 (6042), 642-646 (2011).
  13. Filonov, G. S., Moon, J. D., Svensen, N., Jaffrey, S. R. Broccoli: Rapid selection of an RNA mimic of green fluorescent protein by fluorescence-based selection and directed evolution. Journal of the American Chemical Society. 136 (46), 16299-16308 (2014).
  14. Song, W., Strack, R. L., Svensen, N., Jaffrey, S. R. Plug-and-play fluorophores extend the spectral properties of spinach. Journal of the American Chemical Society. 136 (4), 1198-1201 (2014).
  15. Sambrook, J., Fritsch, E., Maniatis, T. . Molecular Cloning: A Laboratory Manual. , (1989).
  16. Basch, H., Gadebusch, H. H. In vitro antimicrobial activity of dimethylsulfoxide. Applied Microbiology. 16 (12), 1953-1954 (1968).
  17. Kallansrud, G., Ward, B. A comparison of measured and calculated single- and double-stranded oligodeoxynucleotide extinction coefficients. Analytical Biochemistry. 236 (1), 134-138 (1996).
  18. Wilson, S. C., Cohen, D. T., Wang, X. C., Hammond, M. C. A neutral pH thermal hydrolysis method for quantification of structured RNAs. RNA. 20 (7), 1153-1160 (2014).
  19. Szatmári, D., et al. Intracellular ion concentrations and cation-dependent remodelling of bacterial MreB assemblies. Scientific Reports. 10, 12002 (2020).
  20. Boulos, L., Prévost, M., Barbeau, B., Coallier, J., Desjardins, R. LIVE/DEAD® BacLightTM: Application of a new rapid staining method for direct enumeration of viable and total bacteria in drinking water. Journal of Microbiological Methods. 37 (1), 77-86 (1999).
  21. Huang, H., et al. A G-quadruplex-containing RNA activates fluorescence in a GFP-like fluorophore. Nature Chemical Biology. 10 (8), 686-691 (2014).
  22. Jeng, S. C. Y., Chan, H. H. Y., Booy, E. P., McKenna, S. A., Unrau, P. J. Fluorophore ligand binding and complex stabilization of the RNA Mango and RNA Spinach aptamers. RNA. 22 (12), 1884-1892 (2016).
  23. Han, K. Y., Leslie, B. J., Fei, J., Zhang, J., Ha, T. Understanding the photophysics of the Spinach-DFHBI RNA aptamer-fluorogen complex to improve live-cell RNA imaging. Journal of the American Chemical Society. 135 (50), 19033-19038 (2013).
  24. Wang, P., et al. Photochemical properties of Spinach and its use in selective imaging. Chemical Science. 4 (7), 2865-2873 (2013).
  25. Dao, N. T., et al. Photophysics of DFHBI bound to RNA aptamer Baby Spinach. Scientific Reports. 11, 7356 (2021).

Play Video

Bu Makaleden Alıntı Yapın
Mumbleau, M. M., Meyer, M. R., Hammond, M. C. Determination of In Vitro and Cellular Turn-on Kinetics for Fluorogenic RNA Aptamers. J. Vis. Exp. (186), e64367, doi:10.3791/64367 (2022).

View Video