Özet

Détermination de la cinétique d’activation in vitro et cellulaire pour les aptamères d’ARN fluorogéniques

Published: August 09, 2022
doi:

Özet

Le protocole présente deux méthodes pour déterminer la cinétique des aptamères d’ARN fluorogéniques Spinach2 et Brocoli. La première méthode décrit comment mesurer la cinétique des aptamères fluorogéniques in vitro avec un lecteur de plaques, tandis que la deuxième méthode détaille la mesure de la cinétique des aptamères fluorogéniques dans les cellules par cytométrie en flux.

Abstract

Des aptamères d’ARN fluorogéniques ont été appliqués dans des cellules vivantes pour marquer et visualiser les ARN, rendre compte de l’expression des gènes et activer des biocapteurs fluorescents qui détectent les niveaux de métabolites et de molécules de signalisation. Afin d’étudier les changements dynamiques dans chacun de ces systèmes, il est souhaitable d’obtenir des mesures en temps réel, mais la précision des mesures dépend de la cinétique de la réaction fluorogénique plus rapide que la fréquence d’échantillonnage. Ici, nous décrivons des méthodes pour déterminer la cinétique d’activation in vitro et cellulaire pour les aptamères d’ARN fluorogénique à l’aide d’un lecteur de plaques équipé respectivement d’un injecteur d’échantillon et d’un cytomètre en flux. Nous montrons que la cinétique in vitro pour l’activation de fluorescence des aptamères Spinach2 et Brocoli peut être modélisée comme des réactions d’association à deux phases et ont différentes constantes de vitesse de phase rapide de 0,56 s-1 et 0,35 s-1, respectivement. De plus, nous montrons que la cinétique cellulaire pour l’activation de fluorescence des épinards2 chez Escherichia coli, qui est encore limitée par la diffusion du colorant dans les bactéries à Gram négatif, est encore suffisamment rapide pour permettre une fréquence d’échantillonnage précise sur l’échelle de temps infime. Ces méthodes d’analyse de la cinétique d’activation de fluorescence sont applicables à d’autres aptamères d’ARN fluorogéniques qui ont été développés.

Introduction

Les réactions fluorogéniques sont des réactions chimiques qui génèrent un signal de fluorescence. Les aptamères d’ARN fluorogénique remplissent généralement cette fonction en liant un colorant à petite molécule pour améliorer son rendement quantique de fluorescence (Figure 1A)1. Différents systèmes d’aptamères d’ARN fluorogéniques ont été développés et se composent de séquences d’aptamères d’ARN spécifiques et des ligands colorants correspondants1. Des aptamères d’ARN fluorogéniques ont été ajoutés aux transcrits d’ARN sous forme de marqueurs fluorescents qui permettent l’imagerie de cellules vivantes d’ARNm et d’ARN non codants 2,3,4. Ils ont également été placés après des séquences promotrices en tant que rapporteurs fluorescents de l’expression génique, similaire à l’utilisation de la protéine fluorescente verte (GFP) comme rapporteur, sauf que la fonction de déclaration est au niveau de l’ARN 5,6. Enfin, des aptamères d’ARN fluorogéniques ont été incorporés dans des biocapteurs fluorescents à base d’ARN, conçus pour déclencher la réaction fluorogénique en réponse à une petite molécule spécifique. Des biocapteurs fluorescents à base d’ARN ont été développés pour l’imagerie de cellules vivantes de divers métabolites non fluorescents et molécules de signalisation 7,8,9,10,11.

Il y a un intérêt croissant pour le développement d’aptamères d’ARN fluorogéniques pour visualiser les changements dynamiques dans la localisation de l’ARN, l’expression des gènes et les signaux de petites molécules. Pour chacune de ces applications, il est souhaitable d’obtenir des mesures en temps réel, mais la précision des mesures dépend de la cinétique de la réaction fluorogénique plus rapide que la fréquence d’échantillonnage. Ici, nous décrivons des méthodes pour déterminer la cinétique in vitro des aptamères d’ARN fluorogéniques Spinach2 12 et Brocoli13 à l’aide d’un lecteur de plaques équipé d’un injecteur d’échantillon et pour déterminer la cinétique d’activation cellulaire pourSpinach2 exprimée dans Escherichia coli à l’aide d’un cytomètre en flux. Ces deux aptamères d’ARN ont été choisis parce qu’ils ont été appliqués pour étudier la localisation de l’ARN 2,3,4, ils ont été utilisés dans les rapporteurs5,6 et les biocapteurs 7,8,9,10,11, et les ligands colorants correspondants (DFHBI ou DFHBI-1T) sont disponibles dans le commerce. Un résumé de leurs propriétés in vitro déterminées dans la littérature est présenté dans le tableau 1 4,13,14, qui a éclairé l’élaboration du protocole (p. ex., les longueurs d’onde et les concentrations de colorant utilisées). Ces résultats démontrent que les réactions fluorogéniques affectées par les aptamères d’ARN sont rapides et ne devraient pas empêcher des mesures précises pour les applications biologiques cellulaires souhaitées.

Protocol

1. Expérience de cinétique in vitro Préparation de modèles d’ADN par PCRConfigurer la ou les réactions PCR : Pour préparer les réactions PCR, combinez les réactifs suivants dans un tube PCR à paroi mince :33 μL d’eau bidistillée (ddH2O)10 μL de tampon 5x pour ADN polymérase haute fidélité5 μL de 2 mM de désoxyribonucléoside triphosphate (dNTP)0,5 μL d’amorce avant de 40 μM0,5 μL d’amorce inverse 40 μM0,5 μL (10-1…

Representative Results

Cinétique in vitroLes séquences des matrices et des amorces d’ADN, qui sont achetées comme oligonucléotides synthétiques, sont présentées dans le tableau 2, et les recettes de réactifs sont présentées dans le fichier supplémentaire 1. L’amplification par PCR est utilisée pour augmenter la quantité de matrice d’ADN avec le promoteur T7, ce qui est nécessaire pour la réaction ultérieure de transcription in vitro </em…

Discussion

Pour l’expérience de cinétique in vitro, le même protocole général peut être modifié pour mesurer la cinétique in vitro d’un biocapteur fluorescent à base d’ARN contenant à la fois un domaine de liaison au ligand et un domaine de liaison au fluorophore 8. Dans ce cas, l’ARN doit être incubé avec le fluorophore avant les mesures lors de l’injection du ligand afin d’obtenir la cinétique de réponse du ligand. Si une grande variabilité est observée entre l…

Açıklamalar

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Ce travail a été soutenu par les subventions suivantes à MCH: NSF-BSF 1815508 et NIH R01 GM124589. MRM a été partiellement soutenu par la subvention de formation NIH T32 GM122740.

Materials

Agarose Thermo Fischer Scientific BP160500
Agarose gel electrophoresis equipment Thermo Fischer Scientific B1A-BP
Alpha D-(+)-lactose monohydrate Thermo Fischer Scientific 18-600-440
Amber 1.5 mL microcentrifuge tubes Thermo Fischer Scientific 22431021
Ammonium persulfate (APS) Sigma-Aldrich A3678
Ammonium sulfate ((NH4)2SO4) Sigma-Aldrich A4418
Attune NxT Flow cytometer Thermo Fischer Scientific A24861
Attune 1x Focusing Fluid Thermo Fischer Scientific A24904
Attune Shutdown Solution Thermo Fischer Scientific A24975
Attune Performance Tracking Beads Thermo Fischer Scientific 4449754
Attune Wash Solution Thermo Fischer Scientific  J24974
Boric acid Sigma-Aldrich B6768
Bromophenol blue Sigma-Aldrich B0126
Carbenicillin disodium salt Sigma-Aldrich C3416
Chlorine Bleach Amazon B07J6FJR8D
Corning Costar 96-well plate Daigger Scientific EF86610A
Culture Tubes, 12 mm x 75 mm, 5 mL with attached dual position cap Globe Scientific 05-402-31
DFHBI Sigma-Aldrich SML1627
DFHBI-1T Sigma-Aldrich SML2697
D-Glucose (anhydrous) Acros Organics AC410955000
Dimethyl sulfoxide (DMSO) Sigma-Aldrich D8418
Dithiothreitol (DTT) Sigma-Aldrich DTT-RO
DNA loading dye New England Biolabs B7025S
DNA LoBind Tubes (2.0 mL) Eppendorf 22431048
dNTPs: dATP, dCTP, dGTP, dTTP New England Biolabs N0446S
EDTA, pH 8.0 Gibco, Life Technologies AM9260G
Ethanol (EtOH) Sigma-Aldrich E7023
Filter-tip micropipettor tips Thermo Fischer Scientific AM12635, AM12648, AM12655, AM12665
FlowJo Software BD Biosciences N/A FlowJo v10 Software
Fluorescent plate reader with heating control VWR 10014-924
Gel electrophoresis power supply Thermo Fischer Scientific EC3000XL2
Glycerol Sigma-Aldrich G5516
Glycogen AM95010 Thermo Fischer Scientific AM95010
GraphPad Prism Dotmatics N/A Analysis software from Academic Group License 
Heat block  Thomas Scientific 1159Z11
HEPES Sigma-Aldrich H-4034
Inorganic pyrophosphatase Sigma-Aldrich I1643-500UN
Low Molecular Weight DNA Ladder New England Biolabs N3233L Supplied with free vial of Gel Loading Dye, Purple (6x), no SDS (NEB #B7025).
Magnesium chloride hexahydrate (MgCl2) Sigma-Aldrich M2670
Magnesium sulfate (MgSO4) Fisher Scientific MFCD00011110
Microcentrifuge tubes (1.5 mL) Eppendorf 22363204
Microcentrifuge with temperature control Marshall Scientific EP-5415R
Micropipettors Gilson FA10001M, FA10003M, FA10005M, FA10006M
Micropipettor tips Sigma-Aldrich Z369004, AXYT200CR, AXYT1000CR
Millipore water filter with BioPak unit Sigma-Aldrich CDUFBI001, ZRQSVR3WW
Narrow micropipettor pipette tips DOT Scientific RN005R-LRS
PBS, 10x Thermo Fischer Scientific BP39920
PCR clean-up kit Qiagen 28181
PCR primers and templates Integrated DNA technologies
PCR thermocycler for thin-walled PCR tubes Bio-Rad 1851148
PCR thermocycler for 0.5 mL tubes Techne 5PRIME/C
pET31b-T7-Spinach2 Plasmid Addgene Plasmid #79783
Phusion High-Fidelity DNA polymerase  New England Biolabs M0530L Purchase of Phusion High-Fideldity Enzyme is supplied with 5x Phusion HF Buffer, 5x Phusion GC Buffer, and MgCl2 and DMSO solutions.
Polyacrylamide gel electrophoresis gel comb, C.B.S. Scientific C.B.S. Scientific VGC-1508
Polyacrylamide gel electrophoresis equipment C.B.S. Scientific ASG-250
Potassium chloride (KCl) Sigma-Aldrich P9333
Potassium phosphate monobasic Sigma-Aldrich P5655
Razor blades Genesee Scientific 38-101
rNTPs: ATP, CTP, GTP, UTP New England Biolabs N0450L
SDS Sigma-Aldrich L3771
Short wave UV light source Thermo Fischer Scientific 11758221
Sodium carbonate (Na2CO3) Sigma-Aldrich S7795
Sodium chloride (NaCl) Sigma-Aldrich S7653
Sodium hydroxide (NaOH) Sigma-Aldrich S8045
Sodium phosphate dibasic, anhydrous Thermo Fischer Scientific S375-500
SoftMax Pro Molecular Devices N/A SoftMax Pro 6.5.1 (platereader software) obtained through Academic Group License
Sterile filter units Thermo Fischer Scientific 09-741-88
Sucrose Sigma-Aldrich S0389
SYBR Safe DNA gel stain Thermo Fischer Scientific S33102
TAE buffer for agarose gel electrophoresis Thermo Fischer Scientific AM9869
Tetramethylethylenediamine (TEMED) Sigma-Aldrich T9281
Tris base Sigma-Aldrich TRIS-RO
Tryptone (granulated) Thermo Fischer Scientific M0251S
T7 RNA polymerase New England Biolabs M0251S
Urea-PAGE Gel system  National Diagnostics EC-833
UV fluorescent TLC plate Sigma-Aldrich 1.05789.0001
UV/Vis spectrophotometer Thermo Fischer Scientific ND-8000-GL
Vortex mixer Thermo Fischer Scientific 2215415
Xylene cyanol Sigma-Aldrich X4126
Yeast Extract (Granulated) Thermo Fischer Scientific BP9727-2

Referanslar

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