Özet

הדמיה של הדינמיקה הקונפורמציונית של קולטני ממברנה באמצעות FRET של מולקולה בודדת

Published: August 17, 2022
doi:

Özet

מחקר זה מציג הליך מפורט לביצוע ניסויים של העברת אנרגיה בתהודה פלואורסצנטית של מולקולה בודדת (smFRET) על קולטנים מצומדים לחלבון G (GPCRs) באמצעות תיוג ספציפי לאתר באמצעות שילוב חומצות אמינו לא טבעיות (UAA). הפרוטוקול מספק מדריך שלב אחר שלב להכנת דגימות smFRET, ניסויים וניתוח נתונים.

Abstract

יכולתם של תאים להגיב לאותות חיצוניים חיונית להתפתחות התאים, לגדילתם ולהישרדותם. כדי להגיב לאות מהסביבה, תא חייב להיות מסוגל לזהות ולעבד אותו. משימה זו מסתמכת בעיקר על תפקודם של קולטני הממברנה, שתפקידם להמיר אותות לשפה הביוכימית של התא. קולטנים מצומדים לחלבון G (GPCRs) מהווים את המשפחה הגדולה ביותר של חלבוני קולטני ממברנה בבני אדם. בקרב GPCRs, קולטני גלוטמט מטאבוטרופיים (mGluRs) הם תת-מחלקה ייחודית המתפקדת כדימרים מחייבים ובעלת תחום חוץ-תאי גדול המכיל את אתר קשירת הליגנד. ההתקדמות האחרונה במחקרים מבניים של mGluRs שיפרה את ההבנה של תהליך ההפעלה שלהם. עם זאת, התפשטות של שינויים קונפורמיים בקנה מידה גדול באמצעות mGluRs במהלך ההפעלה והמודולציה אינה מובנת היטב. העברת אנרגיית תהודה פלואורסצנטית של מולקולה בודדת (smFRET) היא טכניקה רבת עוצמה להמחשה וכימות של הדינמיקה המבנית של ביומולקולות ברמת החלבון הבודד. כדי להמחיש את התהליך הדינמי של הפעלת mGluR2, פותחו חיישנים קונפורמיים פלואורסצנטיים המבוססים על שילוב לא טבעי של חומצות אמינו (UAA) שאפשרו תיוג חלבונים ספציפיים לאתר ללא הפרעה למבנה המקומי של קולטנים. הפרוטוקול המתואר כאן מסביר כיצד לבצע ניסויים אלה, כולל הגישה החדשנית לתיוג UAA, הכנת דגימות ואיסוף וניתוח נתוני smFRET. אסטרטגיות אלה ניתנות להכללה וניתן להרחיב אותן כדי לחקור את הדינמיקה הקונפורמציונית של מגוון חלבוני ממברנה.

Introduction

העברת המידע על פני קרום הפלזמה תלויה במידה רבה בתפקוד קולטני הממברנה1. קשירת ליגנד לקולטן מובילה לשינוי קונפורמציה ולהפעלת קולטן. תהליך זה הוא לעתים קרובות allosteric בטבע2. עם למעלה מ-800 חברים, קולטנים מצומדים לחלבון G (GPCRs) הם המשפחה הגדולה ביותר של קולטני ממברנה בבני אדם3. בשל תפקידם כמעט בכל התהליכים התאיים, GPCRs הפכו ליעדים חשובים לפיתוח טיפולי. במודל הקנוני של איתות GPCR, הפעלת אגוניסט גורמת לשינויים קונפורמיים של הקולטן המפעילים לאחר מכן את קומפלקס חלבון G ההטרוטרימרי באמצעות חילופי תמ”ג עבור GTP בכיס קשירת הנוקלאוטידים שלG α. יחידות המשנה המופעלות Gα-GTP ו-Gβγ שולטות בפעילות של חלבוני אפקטים במורד הזרם ומפיצות את מפל האיתות 4,5. תהליך איתות זה תלוי למעשה ביכולתם של ליגנדים לשנות את הצורה התלת-ממדית של הקולטן. הבנה מכניסטית של האופן שבו ליגנדות משיגות זאת היא קריטית לפיתוח טיפולים חדשים ולתכנון קולטנים וחיישנים סינתטיים.

קולטני גלוטמט מטאבוטרופיים (mGluRs) הם חברים במשפחת ה-GPCR מדרגה C והם חשובים להשפעות הנוירומודולטוריות האיטיות של גלוטמט וכוונון הרגישות העצבית 6,7. מבין כל ה-GPCRs, GPCRs מסוג C הם ייחודיים מבחינה מבנית בכך שהם מתפקדים כדימרים מחייבים. mGluRs מכילים שלושה תחומים מבניים: תחום מלכודת הזבובים של ונוס (VFT), תחום עשיר בציסטאין (CRD) ותחום טרנס-ממברנה (TMD)8. השינויים הקונפורמיים במהלך תהליך ההפעלה הם מורכבים וכוללים צימוד קונפורמציה מקומי וגלובלי המתפשט על פני מרחק של 12 ננומטר, כמו גם שיתוף פעולה עמום. תצורות הביניים, הסדר הזמני של המצבים וקצב המעבר בין מדינות אינם ידועים. על ידי ביצוע קונפורמציה של קולטנים בודדים בזמן אמת, ניתן לזהות את מצבי הביניים החולפים ואת רצף השינויים הקונפורמיים במהלך ההפעלה. ניתן להשיג זאת על ידי יישום העברת אנרגיית תהודה פלואורסצנטית של מולקולה בודדת 9,10 (smFRET), כפי שיושם לאחרונה כדי לדמיין את התפשטות השינויים הקונפורמיים במהלך ההפעלה של mGluR2 11. שלב מפתח בניסויי FRET הוא יצירת חיישני FRET על ידי החדרה ספציפית לאתר של התורם והמקבל פלואורופורים לחלבון המעניין. אסטרטגיית שילוב של חומצות אמינו לא טבעיות (UAA) אומצה12,13,14,15 כדי להתגבר על המגבלות של טכנולוגיות תיוג פלואורסצנטיות טיפוסיות ספציפיות לאתר הדורשות יצירת מוטנטים ללא ציסטאין או החדרת תג גדול המקודד גנטית. זה איפשר את הסידור מחדש הקונפורמי של המקשר האלוסטרי הקומפקטי החיוני, שהצטרף לתחומי קשירת הליגנד והאיתות של mGluR2, כדי להיות נצפה. בפרוטוקול זה מוצג מדריך שלב אחר שלב לביצוע ניסויי smFRET ב- mGluR2, כולל הגישה לתיוג ספציפי לאתר של mGluR2 עם UAA להצמדת פלואורופורים באמצעות תגובת מחזור אזיד מזורזת נחושת. יתר על כן, פרוטוקול זה מתאר את המתודולוגיה ללכידה ישירה של חלבוני ממברנה וניתוח נתונים. הפרוטוקול המתואר כאן ישים גם לחקר הדינמיקה הקונפורמציונית של חלבוני ממברנה אחרים.

Protocol

זרימת העבודה הכוללת של הפרוטוקול מתוארת באיור 1. 1. הכנת תא הדגימה ניקוי מגלשות וכיסוייםהערה: שלבים אלה נועדו לנקות את המשטחים של השקופיות כמו גם את הכיסויים ולהכין אותם לאמינוזילניזציה. אחת הדרישות הקריטיות לביצוע ניסויים פלואורסצנטיים של מולקול?…

Representative Results

הבעה ותיוג פלואורסצנטי של חיישן FRET מבוסס UAAכאןנדונו תוצאות מופת של החדרה ותיוג פלואורסצנטי של UAA (AZP) בתוך ה-CRD של mGluR2 (548UAA). כפי שצוין קודם לכן, כדי להכניס AZP ל-mGluR2, יש צורך בביטוי משותף של מנגנון התרגום המהונדס, הכולל סינתזה tRNA שונה ו-tRNA משלים (pIRE4-Azi), ו-mGluR2 המכיל קודון ענ…

Discussion

GPCRs הם חלבונים הפועלים על קרום התא כדי ליזום התמרת אותות. GPCRs רבים מורכבים ממספר תחומים, כאשר האיתות תלוי באינטראקציה השיתופית בין התחומים. כדי לווסת את המאפיינים של קולטני ממברנה אלה, חיוני להבין את ההתנהגות הדינמית של התחומים המרובים. העברת אנרגיית תהודה פלואורסצנטית חד-מולקולתית (smFRET) ה?…

Açıklamalar

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

אנו מודים לחברי מעבדת רזא ופאבח’ש על הדיונים. עבודה זו נתמכה על ידי מענק המכונים הלאומיים לבריאות R01GM140272 (ל- R.V.), על ידי קרן המנהיגות של סירל למדעי החיים באוניברסיטת נורת’ווסטרן, ועל ידי הקונסורציום הביו-רפואי של שיקגו בתמיכת קרנות סירל בקרן הקהילה של שיקגו (ל- R.V.). B.W.L. נתמך על ידי מענק ההדרכה של המכון הלאומי למדעי הרפואה הכללית (NIGMS) T32GM-008061.

Materials

(+)-Sodium L-Ascorbate Sigma Aldrich Cat # 11140-250G
4-azido-L-phenylalanine Chem-Impex International Cat # 06162
548UAA Liauw et al. 2021 Transfected construct
Acetic Acid Fisher Chemical 64-19-7
Acetone Fisher Chemical 67-64-1
Adobe Illustrator (2022) https://www.adobe.com/ RRID:SCR_010279 Software, algorithm
Aminoguanidine (hydrochloride) Cayman Chemical 81530
Aminosilane Aldrich 919-30-2
Bath Sonicator 2.8 L Fisher Scientific Ultrasonic Bath 2.8 L
Biotin-PEG Laysan Bio Inc Item# Biotin-PEG-SVA-5000-100mg
BTTES Click Chemistry Tools 1237-500
Copper (II) sulfate Sigma Aldrich Cat # 451657-10G
Cover slip VWR 16004-306 Sample chamber
Cy3 Alkyne Click Chemistry Tools TA117-5
Cy5 Alkyne Click Chemistry Tools TA116-5
DDM Anatrace Part# D310 1 GM Detergent
DDM-CHS (10:1) Anatrace Part# D310-CH210 1 ML Detergent with cholecterol
Defined Fetal Bovine Serum Thermo Fisher Scientific SH30070.03
Di01-R405/488/561/635 Semrock Notch filter
DMEM Corning 10-013-CV
EMCCD Andor DU-897U Camera
ET542lp Chroma Long pass emission filter
FF640-FDi01 Semrock Emission dichroic filter
FLAG-tag antibody Genscript A01429
Fluorescent bead Invitrogen T7279 TetraSpeck microspheres Spherical bead
Glass slides Fisherfinest 12-544-4 sample chamber
Glutamate Sigma Aldrich Cat # 6106-04-3
HEK 293T Sigma Aldrich Cat # 12022001 Cell line
HEPES FisherBioReagents 7365-45-9
Image splitter OptoSplit II
KOH Fluka 1310-58-3
Laser Oxxius 4-line laser combiner
Lipofectamine 3000 Transfection Reagent Thermo Fisher Scientific L3000015 Transfection Reagent
Methanol Fisher Chemical 67-56-1
Microscope Olympus Olympus IX83
Milli-Q water Barnstead Water Deionizer
m-PEG Laysan Bio Inc Item# MPEG-SIL-5000-1g
NF03-405/488/532/635 Semrock Dichroic mirror
OptiMEM Thermo Fisher Scientific 51985091 Reduced Serum Medium
OptiMEM/Reduced serum medium Thermo Fisher Scientific
OriginPro (2020b) https://www.originlab.com/ RRID:SCR_014212 Data analysis and graphing software
Penicillin-Streptomycin Gibco 15140-122
pIRE4-Azi Addgene Plasmid # 105829 Transfected construct
Poly-L-lysine hydrobromide Sigma Aldrich Cat # P2636
Protocatechuic acid (PCA) HWI group 99-50-3
smCamera (Version 1.0) http://ha.med.jhmi.edu/resources/ Camera software
Sodium bicarbonate FisherBioReagents 144-55-8
Sodium hydroxide (NaOH) Sigma 1310-73-2
Syringe filter Whatman UNIFLO Cat#9914-2502 Liquid filtration
Trolox Sigma 53188-07

Referanslar

  1. Smock, R. G., Gierasch, L. M. Sending signals dynamically. Science. 324 (5924), 198-203 (2009).
  2. Changeux, J. P., Christopoulos, A. Allosteric modulation as a unifying mechanism for receptor function and regulation. Cell. 166 (5), 1084-1102 (2016).
  3. Tang, X. -. l., Wang, Y., Li, D. -. l., Luo, J., Liu, M. -. Y. Orphan G protein-coupled receptors (GPCRs): biological functions and potential drug targets. Acta Pharmacologica Sinica. 33 (3), 363-371 (2012).
  4. Chung, K. Y., et al. Conformational changes in the G protein Gs induced by the β2 adrenergic receptor. Nature. 477 (7366), 611-615 (2011).
  5. Vafabakhsh, R., Levitz, J., Isacoff, E. Y. Conformational dynamics of a class C G-protein-coupled receptor. Nature. 524 (7566), 497-501 (2015).
  6. Niswender, C. M., Conn, P. J. Metabotropic glutamate receptors: Physiology, pharmacology, and disease. Annual Review of Pharmacology and Toxicology. 50, 295-322 (2010).
  7. Pin, J. P., Bettler, B. Organization and functions of mGlu and GABA(B) receptor complexes. Nature. 540 (7631), 60-68 (2016).
  8. Kniazeff, J., et al. Closed state of both binding domains of homodimeric mGlu receptors is required for full activity. Nature Structural & Molecular Biology. 11 (8), 706-713 (2004).
  9. Ha, T. Single-molecule fluorescence resonance energy transfer. Methods. 25 (1), 78-86 (2001).
  10. Schuler, B., Eaton, W. A. Protein folding studied by single-molecule FRET. Current Opinion in Structural Biology. 18 (1), 16-26 (2008).
  11. Liauw, B. W. -. H., Afsari, H. S., Vafabakhsh, R. Conformational rearrangement during activation of a metabotropic glutamate receptor. Nature Chemical Biology. 17 (3), 291-297 (2021).
  12. Noren, C. J., Anthonycahill, S. J., Griffith, M. C., Schultz, P. G. A general method for site-specific incorporation of unnatural amino acids into proteins. Science. 244 (4901), 182-188 (1989).
  13. Presolski, S. I., Hong, V. P., Finn, M. Copper-catalyzed azide-alkyne click chemistry for bioconjugation. Current Protocols in Chemical Biology. 3 (4), 153-162 (2011).
  14. Huber, T., Naganathan, S., Tian, H., Ye, S. X., Sakmar, T. P. Unnatural amino acid mutagenesis of GPCRs using amber codon suppression and bioorthogonal labeling. G Protein Coupled Receptors: Structure. 520, 281-305 (2013).
  15. Serfling, R., Coin, I., Pecoraro, V. Chapter Four – Incorporation of Unnatural Amino Acids into Proteins Expressed in Mammalian Cells. Methods in Enzymology. 580, 89-107 (2016).
  16. Chandradoss, S. D., et al. Surface passivation for single-molecule protein studies. Journal of Visualized Experiments. (86), e50549 (2014).
  17. Rasnik, I., McKinney, S. A., Ha, T. Nonblinking and long-lasting single-molecule fluorescence imaging. Nature Methods. 3 (11), 891-893 (2006).
  18. Cordes, T., Vogelsang, J., Tinnefeld, P. On the mechanism of Trolox as antiblinking and antibleaching reagent. Journal of the American Chemical Society. 131 (14), 5018-5019 (2009).
  19. Aitken, C. E., Marshall, R. A., Puglisi, J. D. An oxygen scavenging system for improvement of dye stability in single-molecule fluorescence experiments. Biophysical Journal. 94 (5), 1826-1835 (2008).
  20. Lee, S., et al. How do short chain nonionic detergents destabilize G-protein-coupled receptors. Journal of the American Chemical Society. 138 (47), 15425-15433 (2016).
  21. Cao, A. -. M., et al. Allosteric modulators enhance agonist efficacy by increasing the residence time of a GPCR in the active state. Nature Communications. 12 (1), 1-13 (2021).
  22. Mancebo, A., Mehra, D., Banerjee, C., Kim, D. -. H., Puchner, E. M. Efficient cross-correlation filtering of one-and two-color single molecule localization microscopy data. Frontiers in Bioinformatics. 1, 739769 (2021).
  23. Mehra, D., Adhikari, S., Banerjee, C., Puchner, E. M. Characterizing locus specific chromatin structure and dynamics with correlative conventional and super-resolution imaging in living cells. Nucleic Acids Research. , (2022).
  24. Chen, H., Puhl, H. L., Koushik, S. V., Vogel, S. S., Ikeda, S. R. Measurement of FRET efficiency and ratio of donor to acceptor concentration in living cells. Biophysical Journal. 91 (5), 39-41 (2006).
  25. Gopich, I. V., Szabo, A. FRET efficiency distributions of multistate single molecules. The Journal of Physical Chemistry B. 114 (46), 15221-15226 (2010).
  26. Roy, R., Hohng, S., Ha, T. A practical guide to single-molecule FRET. Nature Methods. 5 (6), 507-516 (2008).
  27. Hellenkamp, B., et al. Precision and accuracy of single-molecule FRET measurements-A multi-laboratory benchmark study. Nature Methods. 15 (9), 669-676 (2018).
  28. Bronson, J. E., Fei, J., Hofman, J. M., Gonzalez, R. L., Wiggins, C. H. Learning rates and states from biophysical time series: A Bayesian approach to model selection and single-molecule FRET data. Biophysical Journal. 97 (12), 3196-3205 (2009).
  29. Zhang, J., et al. Specific structural elements of the T-box riboswitch drive the two-step binding of the tRNA ligand. Elife. 7, 39518 (2018).
  30. Goodman, N. R. Statistical analysis based on a certain multivariate complex Gaussian distribution (an introduction). The Annals of Mathematical Statistics. 34 (1), 152-177 (1963).
  31. Brown, R. B., Audet, J. Current techniques for single-cell lysis. Journal of the Royal Society Interface. 5, 131-138 (2008).
  32. Schamber, M. R., Vafabakhsh, R. Mechanism of sensitivity modulation in the calcium-sensing receptor via electrostatic tuning. Nature Communications. 13 (1), 2194 (2022).
  33. Jain, A., Liu, R., Xiang, Y. K., Ha, T. Single-molecule pull-down for studying protein interactions. Nature Protocols. 7 (3), 445-452 (2012).
  34. Huang, S. K., et al. Delineating the conformational landscape of the adenosine A(2A) receptor during G protein coupling. Cell. 184 (7), 1884-1894 (2021).
  35. Wingler, L. M., et al. Angiotensin analogs with divergent bias stabilize distinct receptor conformations. Cell. 176 (3), 468-478 (2019).
  36. Gordon, C. G., et al. Reactivity of biarylazacyclooctynones in copper-free click chemistry. Journal of the American Chemical Society. 134 (22), 9199-9208 (2012).
  37. Kim, E., Koo, H. Biomedical applications of copper-free click chemistry: In vitro, in vivo, and ex vivo. Chemical Science. 10 (34), 7835-7851 (2019).
  38. Pickens, C. J., Johnson, S. N., Pressnall, M. M., Leon, M. A., Berkland, C. J. Practical considerations, challenges, and limitations of bioconjugation via azide-alkyne cycloaddition. Bioconjugate Chemistry. 29 (3), 686-701 (2018).
  39. Geng, Y., et al. Structural mechanism of ligand activation in human calcium-sensing receptor. Elife. 5, 13662 (2016).

Play Video

Bu Makaleden Alıntı Yapın
Banerjee, C., Liauw, B. W., Vafabakhsh, R. Visualizing the Conformational Dynamics of Membrane Receptors Using Single-Molecule FRET. J. Vis. Exp. (186), e64254, doi:10.3791/64254 (2022).

View Video