Özet

Visualisierung der Konformationsdynamik von Membranrezeptoren mit Einzelmolekül-FRET

Published: August 17, 2022
doi:

Özet

Diese Studie stellt ein detailliertes Verfahren zur Durchführung von Einzelmolekül-Fluoreszenz-Resonanzenergietransfer-Experimenten (smFRET) an G-Protein-gekoppelten Rezeptoren (GPCRs) unter Verwendung ortsspezifischer Markierung durch unnatürliche Aminosäureinkorporation (UAA) vor. Das Protokoll bietet eine Schritt-für-Schritt-Anleitung für die Vorbereitung von smFRET-Proben, Experimente und Datenanalysen.

Abstract

Die Fähigkeit von Zellen, auf externe Signale zu reagieren, ist für die Zellentwicklung, das Wachstum und das Überleben unerlässlich. Um auf ein Signal aus der Umgebung reagieren zu können, muss eine Zelle in der Lage sein, es zu erkennen und zu verarbeiten. Diese Aufgabe beruht hauptsächlich auf der Funktion von Membranrezeptoren, deren Aufgabe es ist, Signale in die biochemische Sprache der Zelle umzuwandeln. G-Protein-gekoppelte Rezeptoren (GPCRs) bilden die größte Familie von Membranrezeptorproteinen beim Menschen. Unter den GPCRs sind metabotrope Glutamatrezeptoren (mGluRs) eine einzigartige Unterklasse, die als obligate Dimere fungieren und eine große extrazelluläre Domäne besitzen, die die Ligandenbindungsstelle enthält. Jüngste Fortschritte in Strukturstudien von mGluRs haben das Verständnis ihres Aktivierungsprozesses verbessert. Die Ausbreitung großräumiger Konformationsänderungen durch mGluRs während der Aktivierung und Modulation ist jedoch kaum verstanden. Der Einzelmolekül-Fluoreszenz-Resonanzenergietransfer (smFRET) ist eine leistungsstarke Technik zur Visualisierung und Quantifizierung der Strukturdynamik von Biomolekülen auf Einzelproteinebene. Um den dynamischen Prozess der mGluR2-Aktivierung zu visualisieren, wurden fluoreszierende Konformationssensoren auf Basis des Einbaus von unnatürlichen Aminosäuren (UAA) entwickelt, die eine ortsspezifische Proteinmarkierung ohne Störung der nativen Struktur von Rezeptoren ermöglichten. Das hier beschriebene Protokoll erklärt, wie diese Experimente durchzuführen sind, einschließlich des neuartigen UAA-Markierungsansatzes, der Probenvorbereitung und der smFRET-Datenerfassung und -analyse. Diese Strategien sind verallgemeinerbar und können erweitert werden, um die Konformationsdynamik einer Vielzahl von Membranproteinen zu untersuchen.

Introduction

Die Übertragung von Informationen über die Plasmamembran hängt stark von der Funktion der Membranrezeptorenab 1. Die Bindung von Liganden an einen Rezeptor führt zu einer Konformationsänderung und Rezeptoraktivierung. Dieser Prozess ist oft allosterischer Natur2. Mit über 800 Mitgliedern sind G-Protein-gekoppelte Rezeptoren (GPCRs) die größte Familie von Membranrezeptoren beim Menschen3. Aufgrund ihrer Rolle in fast allen zellulären Prozessen sind GPCRs zu wichtigen Zielen für die therapeutische Entwicklung geworden. Im kanonischen Modell der GPCR-Signalübertragung führt die Agonistenaktivierung zu Konformationsänderungen des Rezeptors, die anschließend den heterotrimeren G-Proteinkomplex durch Austausch von GDP gegen GTP an der Nukleotidbindungstasche von Gα aktivieren. Die aktiviertenG-α-GTP– undG-βγ-Untereinheiten steuern dann die Aktivität nachgeschalteter Effektorproteine und propagieren die Signalkaskade 4,5. Dieser Signalprozess hängt wesentlich von der Fähigkeit der Liganden ab, die dreidimensionale Form des Rezeptors zu verändern. Ein mechanistisches Verständnis davon, wie Liganden dies erreichen, ist entscheidend für die Entwicklung neuer Therapeutika und das Design synthetischer Rezeptoren und Sensoren.

Metabotrope Glutamatrezeptoren (mGluR) gehören zur GPCR-Familie der Klasse C und sind wichtig für die langsamen neuromodulatorischen Effekte von Glutamat und die Abstimmung der neuronalen Erregbarkeit 6,7. Unter allen GPCRs sind GPCRs der Klasse C strukturell einzigartig, da sie als obligate Dimere fungieren. mGluRs enthalten drei strukturelle Domänen: die Venusfliegenfalle (VFT), die Cystein-reiche Domäne (CRD) und die Transmembrandomäne (TMD)8. Die Konformationsänderungen während des Aktivierungsprozesses sind komplex und beinhalten lokale und globale Konformationskopplungen, die sich über eine Entfernung von 12 nm ausbreiten, sowie Dimerkooperativität. Die intermediären Konformationen, die zeitliche Ordnung der Zustände und die Übergangsrate zwischen den Zuständen sind unbekannt. Durch die Verfolgung der Konformation einzelner Rezeptoren in Echtzeit ist es möglich, die transienten Zwischenzustände und die Abfolge der Konformationsänderungen während der Aktivierung zu identifizieren. Dies kann durch Anwendung des Einzelmolekül-Fluoreszenzresonanzenergietransfers 9,10 (smFRET) erreicht werden, wie er kürzlich angewendet wurde, um die Ausbreitung von Konformationsänderungen während der Aktivierung von mGluR2 11 zu visualisieren. Ein wichtiger Schritt in FRET-Experimenten ist die Erzeugung von FRET-Sensoren durch ortsspezifisches Einfügen der Donor- und Akzeptorfluorophore in das interessierende Protein. Eine Strategie zur Einbeziehung unnatürlicher Aminosäuren (UAA) wurde 12,13,14,15 angenommen, um die Einschränkungen typischer ortsspezifischer fluoreszierender Markierungstechnologien zu überwinden, die die Schaffung von Cystein-losen Mutanten oder das Einfügen eines großen genetisch kodierten Tags erfordern. Damit konnte die Konformationsumlagerung des essentiellen kompakten allosterischen Linkers beobachtet werden, der die Ligandenbindungs- und Signaldomänen von mGluR2 verband. In diesem Protokoll wird eine Schritt-für-Schritt-Anleitung zur Durchführung von smFRET-Experimenten mit mGluR2 vorgestellt, einschließlich des Ansatzes für die ortsspezifische Markierung von mGluR2 mit UAA zur Bindung von Fluorophoren unter Verwendung der kupferkatalysierten Azidcyclisierungsreaktion. Darüber hinaus beschreibt dieses Protokoll die Methodik für die direkte Erfassung von Membranproteinen und die Datenanalyse. Das hier skizzierte Protokoll ist auch auf die Untersuchung der Konformationsdynamik anderer Membranproteine anwendbar.

Protocol

Der gesamte Workflow des Protokolls wird in Abbildung 1 beschrieben. 1. Vorbereitung der Probenkammer Gleit- und DeckglasreinigungHINWEIS: Diese Schritte zielen darauf ab, die Oberflächen der Objektträger sowie die Deckgläser zu reinigen und für die Aminosilanisierung vorzubereiten. Eine kritische Voraussetzung für die Durchführung von Einzelmolekül-Fluoreszenzexperimenten an oberflächengebundenen Molekülen ist eine passivierte Oberfläc…

Representative Results

Expression und fluoreszierende Markierung des UAA-basierten FRET-SensorsHier werden beispielhafte Ergebnisse der Insertion und Fluoreszenzmarkierung einer LF (AZP) innerhalb der CRD von mGluR2 (548UAA) diskutiert11. Wie bereits erwähnt, ist zum Einfügen von AZP in mGluR2 die Koexpression der technischen translationalen Maschinerie erforderlich, die eine modifizierte tRNA-Synthetase und komplementäre tRNA (pIRE4-Azi) und mGluR2 mit einem bernsteinfarbenen Codon an Position 5…

Discussion

GPCRs sind Proteine, die auf der Zellmembran arbeiten, um die Signaltransduktion einzuleiten. Viele GPCRs bestehen aus mehreren Domänen, wobei die Signalisierung von der kooperativen Interaktion zwischen den Domänen abhängt. Um die Eigenschaften dieser Membranrezeptoren zu modulieren, ist es wichtig, das dynamische Verhalten der verschiedenen Domänen zu verstehen. Einzelmolekül-Fluoreszenz-Resonanzenergietransfer (smFRET) ist eine Fluoreszenztechnik, die die Messung von Proteinkonformation und -dynamik in Echtzeit e…

Açıklamalar

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Wir danken den Mitgliedern des Reza Vafabakhsh Labors für die Diskussionen. Diese Arbeit wurde vom National Institutes of Health Zuschuss R01GM140272 (an R.V.), vom Searle Leadership Fund for the Life Sciences an der Northwestern University und vom Chicago Biomedical Consortium mit Unterstützung der Searle Funds des Chicago Community Trust (an R.V.) unterstützt. B.W.L. wurde vom National Institute of General Medical Sciences (NIGMS) Training Grant T32GM-008061 unterstützt.

Materials

(+)-Sodium L-Ascorbate Sigma Aldrich Cat # 11140-250G
4-azido-L-phenylalanine Chem-Impex International Cat # 06162
548UAA Liauw et al. 2021 Transfected construct
Acetic Acid Fisher Chemical 64-19-7
Acetone Fisher Chemical 67-64-1
Adobe Illustrator (2022) https://www.adobe.com/ RRID:SCR_010279 Software, algorithm
Aminoguanidine (hydrochloride) Cayman Chemical 81530
Aminosilane Aldrich 919-30-2
Bath Sonicator 2.8 L Fisher Scientific Ultrasonic Bath 2.8 L
Biotin-PEG Laysan Bio Inc Item# Biotin-PEG-SVA-5000-100mg
BTTES Click Chemistry Tools 1237-500
Copper (II) sulfate Sigma Aldrich Cat # 451657-10G
Cover slip VWR 16004-306 Sample chamber
Cy3 Alkyne Click Chemistry Tools TA117-5
Cy5 Alkyne Click Chemistry Tools TA116-5
DDM Anatrace Part# D310 1 GM Detergent
DDM-CHS (10:1) Anatrace Part# D310-CH210 1 ML Detergent with cholecterol
Defined Fetal Bovine Serum Thermo Fisher Scientific SH30070.03
Di01-R405/488/561/635 Semrock Notch filter
DMEM Corning 10-013-CV
EMCCD Andor DU-897U Camera
ET542lp Chroma Long pass emission filter
FF640-FDi01 Semrock Emission dichroic filter
FLAG-tag antibody Genscript A01429
Fluorescent bead Invitrogen T7279 TetraSpeck microspheres Spherical bead
Glass slides Fisherfinest 12-544-4 sample chamber
Glutamate Sigma Aldrich Cat # 6106-04-3
HEK 293T Sigma Aldrich Cat # 12022001 Cell line
HEPES FisherBioReagents 7365-45-9
Image splitter OptoSplit II
KOH Fluka 1310-58-3
Laser Oxxius 4-line laser combiner
Lipofectamine 3000 Transfection Reagent Thermo Fisher Scientific L3000015 Transfection Reagent
Methanol Fisher Chemical 67-56-1
Microscope Olympus Olympus IX83
Milli-Q water Barnstead Water Deionizer
m-PEG Laysan Bio Inc Item# MPEG-SIL-5000-1g
NF03-405/488/532/635 Semrock Dichroic mirror
OptiMEM Thermo Fisher Scientific 51985091 Reduced Serum Medium
OptiMEM/Reduced serum medium Thermo Fisher Scientific
OriginPro (2020b) https://www.originlab.com/ RRID:SCR_014212 Data analysis and graphing software
Penicillin-Streptomycin Gibco 15140-122
pIRE4-Azi Addgene Plasmid # 105829 Transfected construct
Poly-L-lysine hydrobromide Sigma Aldrich Cat # P2636
Protocatechuic acid (PCA) HWI group 99-50-3
smCamera (Version 1.0) http://ha.med.jhmi.edu/resources/ Camera software
Sodium bicarbonate FisherBioReagents 144-55-8
Sodium hydroxide (NaOH) Sigma 1310-73-2
Syringe filter Whatman UNIFLO Cat#9914-2502 Liquid filtration
Trolox Sigma 53188-07

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