Сфероиды опухолей все чаще используются для оценки взаимодействия опухолевых клеток и микроокружения и ответа на терапию. Настоящий протокол описывает надежный, но простой метод полувысокопроизводительной визуализации 3D-сфероидов опухолей с использованием быстрой оптической очистки.
Сфероиды опухолей быстро становятся обычным явлением в фундаментальных исследованиях рака и разработке лекарств. Получение данных о экспрессии белка в сфероиде на клеточном уровне важно для анализа, однако существующие методы часто являются дорогостоящими, трудоемкими, используют нестандартное оборудование, вызывают значительные искажения размера или ограничены относительно небольшими сфероидами. Этот протокол представляет собой новый метод монтажа и очистки сфероидов, который решает эти проблемы, позволяя проводить конфокальный анализ внутренней структуры сфероидов. В отличие от существующих подходов, данный протокол предусматривает быстрый монтаж и очистку большого количества сфероидов с использованием стандартного оборудования и лабораторных принадлежностей. Установка сфероидов в рН-нейтральный раствор геля агарозы-PBS перед введением раствора для очистки с показателем преломления сводит к минимуму искажение размера, характерное для других подобных методов. Это позволяет проводить детальный количественный и статистический анализ, где точность измерений размеров имеет первостепенное значение. Кроме того, по сравнению с жидкими растворами для очистки, метод агарозного геля удерживает сфероиды фиксированными на месте, что позволяет собирать трехмерные (3D) конфокальные изображения. В настоящей статье подробно рассматривается, как метод дает высококачественные двух- и 3D-изображения, которые предоставляют информацию о межклеточной изменчивости и внутренней сфероидной структуре.
Трехмерные (3D) клеточные культуры, такие как сфероиды, обеспечивают биологически реалистичные и воспроизводимые модели совокупного роста клеток 1,2. Эти модели быстро становятся обычным явлением как в фундаментальных исследованиях, так и в разработке лекарств, где различия в размере и структуре сфероидов исследуются между методами лечения для определения эффективности препарата 3,4. В этих контекстах способность собирать подробную информацию из большого количества сфероидов очень выгодна, как с точки зрения статистической мощности, так и для быстрой оценки поведения клеток в нескольких методах лечения.
Широко используемые методы получения подробных микроскопических изображений сфероидной структуры либо трудоемки, либо дороги, либо дают изображения низкого качества, которые не сохраняют ключевых количественных характеристик, таких как размер сфероида 4,5. Например, гистологические методы, основанные на криосечении, могут обеспечить высококачественные изображения, но часто отнимают много времени, требуют квалифицированной рабочей силы и часто создают артефакты секционирования 6,7, в то время как элегантные технологии, такие как одноплоскостная микроскопия освещения (SPIM)8 и многофотонная микроскопия9, требуют специализированных микроскопов, которые недоступны. Современные технологии микроскопии в последнее время позволяют проводить так называемое оптическое сечение, при котором сфероиды помещаются в клиринговый раствор с показателем преломления, а изображения получаются с помощью конфокальной микроскопии 4,5. Хотя эти методы имеют потенциал для получения высокой производительности, общие проблемы включают движение сфероидов во время визуализации, искажение размера при очистке и высокую стоимость запатентованных решений для очистки. Кроме того, многие существующие протоколы применяются только к относительно небольшим сфероидам диаметром менее 300 мкм или глубиной до 100 мкм, ограничивая технологию ранними стадиями роста опухоли 5,10,11.
Настоящий протокол позволяет осуществлять полупроизводительный и высокопроизводительный сбор подробных сфероидных изображений с использованием недорогого раствора для очистки рефракционных показателей, полученного из процедур очистки всего органа12,13. Чтобы предотвратить движение сфероидов во время визуализации и обеспечить структурную поддержку для уменьшения искажения размера, сфероиды вмонтированы в гель агароза-PBS в 24-луночную стеклянную нижнюю пластину No 1.5. Поскольку этот метод позволяет устанавливать несколько сфероидов в каждой скважине в 24-луночной пластине, до 360 сфероидов (15 сфероидов / скважина) могут быть быстро установлены и отображены в различных экспериментальных условиях. Для опорожнения, соответствующего показателю преломления, изготовленный из легкодоступных расходных материалов, используется для оптической очистки установленных сфероидов и окружающего геля. После периода успокоения в 24 часа этот протокол обеспечивает высококачественные 2D и 3D изображения структуры сфероидов, даже для относительно больших сфероидов (примерно 700 мкм в диаметре), с искажением размера менее 2%.
Здесь представлен протокол получения качественных двух- и трехмерных изображений сфероидов опухолей. Существующие методы, такие как CLARITY, See deep brain (SeeDB) и ScaleS, часто вызывают искажение размера до 30%, в то время как такие методы, как бензиловый спирт / бензилбензоат (BABB) и 3D-визуализация органов, очищенных растворителем (3DISCO), могут гаснуть флуоресцентный белок18. Многие из этих методов предназначены для очистки тканей со структурной целостностью и искажения размера и структуры при нанесении на сфероиды18. В отличие от других протоколов, которые используют коммерчески доступные дорогостоящие клиринговые решения, этот протокол использует легкодоступные расходные материалы, сохраняя при этом оптическую чистоту и эндогенную флуоресценцию и сводя к минимуму искажения размера. Встраивание сфероидов в гель агароза-PBS обеспечивает структурную поддержку сфероидов и минимизирует осмотический шок при добавлении очищающего раствора. Это имеет решающее значение при визуализации хрупких сфероидов после медикаментозного лечения. Предполагается, что этот метод оптической очистки подходит для сфероидов, образованных любым методом, поскольку этот протокол адаптирован из очистки всей ткани. Предположение основано на сходстве сфероидов, полученном различными методами сфероидного образования. Выбор фиксатора может влиять на размер сфероида, а также на эндогенную флуоресценцию. Этот метод очистки подходит для сфероидов, закрепленных нейтральным 4% раствором PFA. Требуется дальнейшее тестирование, чтобы проверить его совместимость с другими фиксаторами.
Учитывая, что этот метод позволяет одновременно устанавливать несколько сфероидов в многолуночной пластине, он хорошо подходит для трубопроводов количественного анализа, которые требуют информации о структуре сфероидов от 360 сфероидов на 24-луночную пластину. Микроскопы с автоматизированными функциями сценического и пластинчатого картирования могут сделать визуализацию менее ручной. Несмотря на то, что этот метод быстрее и проще, чем секционирование, в настоящее время он не подходит для полной автоматизации. Однако изображения, полученные этим способом, пригодны для автоматизированной обработки изображений 4,19, а скорость, с которой сфероиды могут монтироваться с помощью этого протокола, позволяет проводить количественный анализ внутренней структуры сфероидов 20,21,22.
Для окрашивания целых сфероидов концентрация антител, объем и время инкубации должны быть оптимизированы для каждого антитела. В качестве ориентира используйте 2,5-кратную рекомендуемую концентрацию иммунофлуоресцентных антител 2D и 100-200 мкл антитела в зависимости от количества сфероидов на пробирку. Убедитесь, что все сфероиды покрыты окрашивающим раствором на роторе. Время инкубации зависит от многих факторов, включая размер и плотность сфероидов и антител, и может составлять от 16 до 72 ч. Несмотря на метод, позволяющий обнаруживать сигнал глубже внутри сфероида, флуорофоры, возбуждаемые ультрафиолетовым излучением, вызывают значительное рассеяние света, что приводит к низкому соотношению сигнал/шум. Необходимо соблюдать осторожность при выборе флуорофоров для визуализации целевого белка. Например, окрашивание менее обильных и структурных белков более длинными флуорофорами и более обильными белковыми или ядерными пятнами с более короткими длинами волны флуорофоров позволит достичь наилучшего результата. Наконец, очищенные сфероиды по-прежнему показывают потерю света из-за рассеяния в некротическом ядре, что проявляется в y/z-измерении изображений, полученных из 600 мкм сфероидов (рисунок 2C).
Более высокое увеличение изображения с более высокими объективами NA возможно с сфероидами, установленными и очищенными с использованием этого протокола, но рабочее расстояние объектива ограничивает глубину изображения. Для масляной иммерсионной линзы важно использовать масло, которое имеет RI 1,51 для достижения наилучшего результата.
Подводя итог, можно сказать, что метод встроенной очистки агарозно-PBS gel позволяет визуализировать клетки глубоко внутри сфероидов с использованием общедоступных расходных материалов. Сфероиды, смонтированные и очищенные с помощью этого метода, подвергаются минимальным искажениям размера и сохраняют свою структурную целостность, что позволяет собирать высококачественные данные, касающиеся внутренней структуры сфероида, и последующую автоматическую количественную оценку.
The authors have nothing to disclose.
Это исследование было проведено в Институте трансляционных исследований (TRI), Вуллунгабба, Квинсленд. TRI поддерживается грантом от правительства Австралии. Мы благодарим сотрудников центра микроскопии в TRI за их выдающуюся техническую поддержку. Мы благодарим профессора Ацуси Мияваки, RIKEN, город Вако, Япония, за предоставление конструкций FUCCI, профессора Минхарда Херлина и г-жу Патрисию Браффорд, Институт Вистар, Филадельфия, штат Пенсильвания, за предоставление клеточных линий. Мы благодарим д-ра Лоредану Споэрри за предоставление изображений криосекции C8161.
Эта работа была поддержана проектными грантами N.K.H.: Австралийскому исследовательскому совету (DP200100177) и гранту проекта Meehan (021174 2017002565).
#1.5 glass bottom 24-well plate | Celvis | P24-1.5H-N | |
500 µL clear PCR tubes | Sigma | HS4422 | |
Alexa Fluor 647 AffiniPure Donkey Anti-Mouse IgG (H+L) | Jackson Immuno research | 715-605-151 | Dilution used 1:500 |
Bovine serum albumin | Sigma | A7906 | Final concentration 2% w/v |
DAPI | Sigma | D9542-10MG | Final concentration 5 µg/mL |
Deionized water | MILLI Q | ||
Donkey anti-Rabbit IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 647 | Thermofisher | A-31573 | Dilution used 1:500 |
DRAQ7 | Thermofisher | D15106 | Dilution used 1:250 |
Heating block | Ratek | DBH10 | or similar equipment |
Hypoxyprobe Kits | Hypoxyprobe | HP1-1000Kit | Antibody dilution used 1:500 |
Low-melting agarose powder | Sigma | A9414 | Final concentration 2% w/v |
Microwave | Sharp | ||
N,N,N′,N′-Tetrakis(2-Hydroxypropyl)ethylenediamine | Sigma | 122262 | Final concentration 9% w/w |
NaCl | Sigma | S9888 | Final concentration 150 mM |
NaN3 | Sigma | S2002 | Final concentration 0.10% w/v |
p27 Kip1 (D69C12) XP | Cell Signalling technology | 3686S | Dilution used 1:500 |
Paraformaldehyde solution | Proscitech | C004 | Final concentration 4% w/v |
Phosphate Buffered Saline (PBS) | Thermofisher | 18912014 | Final concentration 1x |
Pipette | Eppendorf | ||
Quickspin minifuge | or similar equipment | ||
Roller | Ratek | BTR10-12V | or similar equipment |
Rotor | Ratek | RSM7DC | or similar equipment |
Shaker | Ratek | EOM5 | or similar equipment |
Sucrose | Sigma | S9378 | Final concentration 44% w/w |
Tris-HCl pH 7.4 | Sigma | T5941 | Final concentration 20 mM |
Triton X-100 | Sigma | X100 | Final concentration 0.10% v/v |
Triton X-100 | Sigma | X100 | Final concentration 0.1% v/v |
Tween 20 | Sigma | P1379 | Final concentration 0.1% v/v |
Urea | Sigma | U5379 | Final concentration 22% w/w |