Tumorsferoïden worden steeds vaker gebruikt om tumorcel-micro-omgevingsinteracties en therapierespons te beoordelen. Het huidige protocol beschrijft een robuuste maar eenvoudige methode voor semi-high-throughput beeldvorming van 3D-tumorsferoïden met behulp van snelle optische clearing.
Tumorsferoïden worden snel gemeengoed in fundamenteel kankeronderzoek en medicijnontwikkeling. Het verkrijgen van gegevens over eiwitexpressie in de sferoïde op cellulair niveau is belangrijk voor analyse, maar bestaande technieken zijn vaak duur, bewerkelijk, gebruiken niet-standaard apparatuur, veroorzaken aanzienlijke vervorming van de grootte of zijn beperkt tot relatief kleine sferoïden. Dit protocol presenteert een nieuwe methode voor het monteren en opruimen van sferoïden die deze problemen aanpakken en tegelijkertijd confocale analyse van de binnenste structuur van sferoïden mogelijk maken. In tegenstelling tot bestaande benaderingen voorziet dit protocol in een snelle montage en opruiming van een groot aantal sferoïden met behulp van standaardapparatuur en laboratoriumbenodigdheden. Het monteren van sferoïden in een pH-neutrale agarose-PBS-geloplossing voordat een refractieve-index-gematchte clearingoplossing wordt geïntroduceerd, minimaliseert de vervorming van de grootte die gebruikelijk is bij andere vergelijkbare technieken. Dit maakt gedetailleerde kwantitatieve en statistische analyse mogelijk waarbij de nauwkeurigheid van maatmetingen van het grootste belang is. Bovendien houdt de agarose-geltechniek, in vergelijking met vloeibare clearingoplossingen, sferoïden op hun plaats, waardoor driedimensionale (3D) confocale beelden kunnen worden verzameld. Het huidige artikel legt uit hoe de methode hoogwaardige twee- en 3D-afbeeldingen oplevert die informatie geven over intercellige variabiliteit en de binnenste sferoïde structuur.
Driedimensionale (3D) celculturen, zoals sferoïden, bieden biologisch realistische en reproduceerbare modellen van geaggregeerde celgroei 1,2. Deze modellen worden snel gemeengoed in zowel fundamenteel onderzoek als medicijnontwikkeling, waarbij verschillen in sferoïde grootte en structuur tussen behandelingen worden onderzocht om de werkzaamheid van geneesmiddelen vast te stellen 3,4. In deze contexten is het vermogen om gedetailleerde informatie te verzamelen van een groot aantal sferoïden zeer voordelig, zowel vanuit een statistisch vermogensperspectief als om een snelle beoordeling van celgedrag over verschillende behandelingen mogelijk te maken.
Veelgebruikte technieken voor het verkrijgen van gedetailleerde microscopiebeelden van de sferoïdestructuur zijn tijdrovend, duur of produceren afbeeldingen van slechte kwaliteit die belangrijke kwantitatieve kenmerken zoals sferoïdegrootte 4,5 niet behouden. Histologische technieken op basis van cryosectie kunnen bijvoorbeeld beelden van hoge kwaliteit opleveren, maar zijn vaak tijdrovend, vereisen geschoolde arbeid en creëren vaak sectieartefacten 6,7, terwijl elegante technologieën, zoals single plane illumination microscopy (SPIM)8 en multifotonmicroscopie9 gespecialiseerde microscopen vereisen die niet direct beschikbaar zijn. Moderne microscopietechnologieën hebben onlangs de zogenaamde optische sectioning mogelijk gemaakt, waarbij sferoïden worden geplaatst in een brekingsindex die overeenkomt met clearingoplossing en beelden worden verkregen met behulp van confocale microscopie 4,5. Hoewel deze technieken het potentieel hebben om een hoge opbrengst te produceren, zijn veel voorkomende problemen sferoïde beweging tijdens beeldvorming, vervorming van de grootte tijdens het wissen en de hoge kosten van eigen clearingoplossingen. Bovendien zijn veel bestaande protocollen alleen van toepassing op relatief kleine sferoïden met een diameter van minder dan 300 μm of een diepte tot 100 μm, waardoor de technologie wordt beperkt tot de vroege stadia van tumorgroei 5,10,11.
Het huidige protocol maakt semi-high-throughput, high-yield verzameling van gedetailleerde sferoïde beelden mogelijk met behulp van een goedkope refractieve index-matched clearingoplossing afgeleid van hele orgaan clearing procedures12,13. Om sferoïde beweging tijdens beeldvorming te voorkomen en structurele ondersteuning te bieden om vervorming van de grootte te verminderen, zijn de sferoïden gemonteerd in agarose-PBS-gel in een 24-well # 1.5 glazen bodemplaat. Omdat deze techniek het mogelijk maakt om meerdere sferoïden in elke put in een 24-well plaat te monteren, kunnen tot 360 sferoïden (15 sferoïden / put) snel worden gemonteerd en in beeld gebracht in verschillende experimentele omstandigheden. Een brekingsindex-matched clearingoplossing gemaakt van direct beschikbare verbruiksartikelen wordt gebruikt om gemonteerde sferoïden en de omliggende gel optisch te verwijderen. Na een bezinkingsperiode van 24 uur biedt dit protocol hoogwaardige 2D- en 3D-beelden van de sferoïdestructuur, zelfs voor relatief grote sferoïden (ongeveer 700 μm in diameter), met minder dan 2% vervorming.
Een protocol voor het verkrijgen van hoogwaardige twee- en driedimensionale beelden van tumorsferoïden wordt hier gepresenteerd. Bestaande methoden, zoals CLARITY, See deep brain (SeeDB) en ScaleS, veroorzaken vaak vervorming van de grootte tot 30%, terwijl technieken zoals BenzylAlcohol / Benzyl Benzoate (BABB) en 3D-beeldvorming van solvent-cleared organen (3DISCO) fluorescerend eiwit kunnen doven18. Veel van deze methoden zijn ontworpen voor het opruimen van weefsel met structurele integriteit en vervormen de grootte en structuur wanneer ze worden toegepast op sferoïden18. In tegenstelling tot andere protocollen die in de handel verkrijgbare dure clearingoplossingen gebruiken, gebruikt dit protocol direct beschikbare verbruiksartikelen met behoud van optische helderheid en endogene fluorescentie en het minimaliseren van vervorming van de grootte. Het inbedden van sferoïden in agarose-PBS-gel biedt structurele ondersteuning voor sferoïden en minimaliseert osmotische schokken wanneer de clearingoplossing wordt toegevoegd. Dit is cruciaal bij het afbeelden van fragiele sferoïden na medicamenteuze behandeling. Er wordt aangenomen dat deze optische clearingmethode geschikt is voor sferoïden die door elke methode worden gevormd, omdat dit protocol is aangepast aan het opruimen van het hele weefsel. De aanname is gebaseerd op de gelijkenis in de sferoïden verkregen door verschillende sferoïde vormingsmethoden. De keuze van fixatief kan de sferoïdegrootte en endogene fluorescentie beïnvloeden. Deze clearingmethode is geschikt voor sferoïden die zijn gefixeerd met een neutrale 4% PFA-oplossing. Verdere tests zijn nodig om de compatibiliteit met andere fixeermiddelen te controleren.
Aangezien deze techniek het mogelijk maakt om meerdere sferoïden tegelijkertijd in een multi-well plaat te monteren, is het zeer geschikt voor kwantitatieve analysepijplijnen die sferoïde structuurinformatie vereisen van maximaal 360 sferoïden per 24-well plaat. Microscopen met geautomatiseerde podium- en plaatkarteringsfuncties kunnen beeldvorming minder handmatig maken. Hoewel deze methode sneller en eenvoudiger is dan secties, is deze momenteel niet geschikt voor volledige automatisering. Beelden verkregen door deze methode zijn echter geschikt voor geautomatiseerde beeldverwerking 4,19, en de snelheid waarmee sferoïden kunnen worden gemonteerd met behulp van dit protocol leent zich voor kwantitatieve analyse van de sferoïde binnenstructuur 20,21,22.
Voor het kleuren van hele sferoïden moeten de antilichaamconcentratie, het volume en de incubatietijd voor elk antilichaam worden geoptimaliseerd. Gebruik als richtlijn 2,5x van de aanbevolen 2D-immunofluorescentie-antilichaamconcentratie en 100-200 μL antilichaam, afhankelijk van het aantal sferoïden per buis. Zorg ervoor dat alle sferoïden bedekt zijn met een kleuringsoplossing wanneer ze zich op de rotor bevinden. De incubatietijd hangt af van vele factoren, waaronder de grootte en dichtheid van sferoïden en het antilichaam, en kan variëren van 16-72 uur. Ondanks de methode die signaaldetectie dieper in de sferoïde mogelijk maakt, veroorzaken fluoroforen die door UV worden aangeslagen een aanzienlijke lichtverstrooiing, wat leidt tot een lage signaal-ruisverhouding. Voorzichtigheid is geboden bij het kiezen van fluoroforen om het doeleiwit te visualiseren. Het kleuren van minder overvloedige en structurele eiwitten met fluoroforen met een langere golflengte en meer overvloedige eiwit- of nucleaire vlekken met fluoroforen met een kortere golflengte zal bijvoorbeeld het beste resultaat bereiken. Ten slotte vertonen gewiste sferoïden nog steeds lichtverlies als gevolg van verstrooiing in de necrotische kern, wat duidelijk blijkt uit de y /z-dimensie van beelden verkregen van 600 μm sferoïden (figuur 2C).
Hogere vergrotingsbeelden met hogere NA-doelstellingen zijn mogelijk met sferoïden die met dit protocol zijn gemonteerd en gewist, maar de werkafstand van het objectief beperkt de beelddiepte. Voor een olie-immersielens is het belangrijk om olie te gebruiken met een RI van 1,51 voor het beste resultaat.
Samenvattend, de agarose-PBS gel embedded clearing methode maakt visualisatie van cellen diep in sferoïden mogelijk met behulp van algemeen beschikbare verbruiksartikelen. Sferoïden die met deze methode zijn gemonteerd en geklaard, ondergaan minimale vervorming van de grootte en behouden hun structurele integriteit, waardoor hoogwaardige gegevens met betrekking tot de binnenste sferoïdestructuur en de daaropvolgende geautomatiseerde kwantificering mogelijk zijn.
The authors have nothing to disclose.
Dit onderzoek werd uitgevoerd aan het Translational Research Institute (TRI), Woolloongabba, QLD. TRI wordt ondersteund door een subsidie van de Australische regering. Wij danken het personeel van de microscopiekernfaciliteit van TRI voor hun uitstekende technische ondersteuning. We danken Prof. Atsushi Miyawaki, RIKEN, Wako-city, Japan, voor het leveren van de FUCCI-constructies, Prof. Meenhard Herlyn en Ms. Patricia Brafford, The Wistar Institute, Philadelphia, PA, voor het leveren van de cellijnen. Wij danken Dr Loredana Spoerri voor het leveren van C8161 cryosectie beelden.
Dit werk werd ondersteund door projectsubsidies aan N.K.H.: Australian Research Council (DP200100177) en Meehan Project Grant (021174 2017002565).
#1.5 glass bottom 24-well plate | Celvis | P24-1.5H-N | |
500 µL clear PCR tubes | Sigma | HS4422 | |
Alexa Fluor 647 AffiniPure Donkey Anti-Mouse IgG (H+L) | Jackson Immuno research | 715-605-151 | Dilution used 1:500 |
Bovine serum albumin | Sigma | A7906 | Final concentration 2% w/v |
DAPI | Sigma | D9542-10MG | Final concentration 5 µg/mL |
Deionized water | MILLI Q | ||
Donkey anti-Rabbit IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 647 | Thermofisher | A-31573 | Dilution used 1:500 |
DRAQ7 | Thermofisher | D15106 | Dilution used 1:250 |
Heating block | Ratek | DBH10 | or similar equipment |
Hypoxyprobe Kits | Hypoxyprobe | HP1-1000Kit | Antibody dilution used 1:500 |
Low-melting agarose powder | Sigma | A9414 | Final concentration 2% w/v |
Microwave | Sharp | ||
N,N,N′,N′-Tetrakis(2-Hydroxypropyl)ethylenediamine | Sigma | 122262 | Final concentration 9% w/w |
NaCl | Sigma | S9888 | Final concentration 150 mM |
NaN3 | Sigma | S2002 | Final concentration 0.10% w/v |
p27 Kip1 (D69C12) XP | Cell Signalling technology | 3686S | Dilution used 1:500 |
Paraformaldehyde solution | Proscitech | C004 | Final concentration 4% w/v |
Phosphate Buffered Saline (PBS) | Thermofisher | 18912014 | Final concentration 1x |
Pipette | Eppendorf | ||
Quickspin minifuge | or similar equipment | ||
Roller | Ratek | BTR10-12V | or similar equipment |
Rotor | Ratek | RSM7DC | or similar equipment |
Shaker | Ratek | EOM5 | or similar equipment |
Sucrose | Sigma | S9378 | Final concentration 44% w/w |
Tris-HCl pH 7.4 | Sigma | T5941 | Final concentration 20 mM |
Triton X-100 | Sigma | X100 | Final concentration 0.10% v/v |
Triton X-100 | Sigma | X100 | Final concentration 0.1% v/v |
Tween 20 | Sigma | P1379 | Final concentration 0.1% v/v |
Urea | Sigma | U5379 | Final concentration 22% w/w |