종양 구상체는 종양 세포-미세환경 상호작용 및 치료 반응을 평가하기 위해 점점 더 활용되고 있다. 본 프로토콜은 신속한 광학 클리어링을 사용하여 3D 종양 구상체의 반고처리량 이미징을 위한 견고하지만 간단한 방법을 기술한다.
종양 구상체는 기본적인 암 연구 및 약물 개발에서 빠르게 보편화되고 있습니다. 세포 수준에서 스페로이드 내 단백질 발현에 관한 데이터를 얻는 것은 분석에 중요하지만, 기존 기술은 종종 비싸고, 힘들며, 비표준 장비를 사용하거나, 상당한 크기 왜곡을 일으키거나, 상대적으로 작은 구상체로 제한됩니다. 이 프로토콜은 구상체의 내부 구조에 대한 공초점 분석을 허용하면서 이러한 문제를 해결하는 구상체를 장착 및 제거하는 새로운 방법을 제시합니다. 기존의 접근 방식과는 달리, 이 프로토콜은 표준 장비 및 실험실 소모품을 사용하여 많은 수의 구상체를 신속하게 장착하고 제거할 수 있도록 합니다. 굴절률 매칭 클리어링 용액을 도입하기 전에 pH-중성 아가로스-PBS 겔 용액에 스페로이드를 장착하면 다른 유사한 기술에 공통적인 크기 왜곡이 최소화됩니다. 이를 통해 크기 측정의 정확도가 가장 중요한 상세한 정량 및 통계 분석이 가능합니다. 또한, 액체 클리어링 솔루션과 비교하여, 아가로스 겔 기술은 구상체를 제자리에 고정시켜 3차원(3D) 공초점 이미지를 수집할 수 있게 합니다. 이 기사에서는 이 방법이 셀 간 가변성 및 내부 스페로이드 구조에 대한 정보를 제공하는 고품질 두 개 및 3D 이미지를 생성하는 방법에 대해 자세히 설명합니다.
구상체와 같은 3차원(3D) 세포 배양물은 집합체 세포 성장(1,2)의 생물학적으로 현실적이고 재현 가능한 모델을 제공한다. 이러한 모델은 약물 효능을 확인하기 위해 치료 사이에 스페로이드 크기와 구조의 차이를 조사하는 기본 연구 및 약물 개발 모두에서 빠르게 보편화되고 있습니다 3,4. 이러한 맥락에서, 많은 수의 구상체로부터 상세한 정보를 수집하는 능력은 통계적 힘의 관점에서 그리고 여러 치료에 걸쳐 세포 거동을 신속하게 평가할 수 있도록 하는 매우 유리하다.
스페로이드 구조의 상세한 현미경 이미지를 얻기 위해 일반적으로 사용되는 기술은 시간이 많이 걸리거나 비용이 많이 들거나 스페로이드 크기 4,5와 같은 주요 정량적 기능을 유지하지 않는 저품질 이미지를 생성합니다. 예를 들어, 냉동 절제술에 기초한 조직학적 기술은 고품질 이미지를 제공할 수 있지만, 종종 시간이 많이 걸리고, 숙련된 노동력이 필요하며, 종종 단면화 인공물(6,7)을 생성하는 반면, 단일 평면 조명 현미경(SPIM)8 및 다중 광자 현미경(multiphoton microscopy)9와 같은 우아한 기술은 쉽게 구할 수 없는 특수 현미경을 필요로 한다. 현대 현미경 기술은 최근에 구상체가 굴절률과 일치하는 클리어링 용액 내에 배치되고 공초점 현미경 4,5를 사용하여 이미지를 얻는 소위 광학 단면화를 가능하게했습니다. 이러한 기술은 높은 수율을 생성 할 수있는 잠재력을 가지고 있지만, 일반적인 문제는 이미징 중 스페로이드 이동, 지우기 중 크기 왜곡 및 독점적 인 클리어링 솔루션의 높은 비용을 포함합니다. 더욱이, 많은 기존 프로토콜은 직경이 300 μm 미만이거나 깊이가 최대 100 μm인 비교적 작은 구상체에만 적용되어, 이 기술을 종양 성장의 초기 단계인 5,10,11로 제한한다.
본 프로토콜은 전체 기관 클리어링 절차(12,13)로부터 유도된 저비용 굴절률-매칭 클리어링 솔루션을 사용하여 상세한 스페로이드 이미지의 반-고처리량, 고수율 수집을 허용한다. 이미징 중 스페로이드 이동을 방지하고 크기 왜곡을 줄이기 위한 구조적 지지대를 제공하기 위해 스페로이드는 24웰 #1.5 유리 바닥판의 agarose-PBS 젤에 장착됩니다. 이 기술을 통해 24웰 플레이트의 각 웰에 여러 개의 스페로이드를 장착할 수 있기 때문에 다양한 실험 조건에서 최대 360개의 스페로이드(15개의 스페로이드/웰)를 신속하게 장착하고 이미징할 수 있습니다. 쉽게 구할 수 있는 소모품으로 구성된 굴절률 일치 클리어링 솔루션은 장착된 구상체와 주변 젤을 광학적으로 제거하는 데 사용됩니다. 24시간의 침전 기간 후에, 이 프로토콜은 2% 미만의 크기 왜곡으로 비교적 큰 구상체(직경 약 700μm)에 대해서도 스페로이드 구조의 고품질 2D 및 3D 이미지를 제공합니다.
종양 구상체의 고품질 이차원 및 입체 이미지를 얻기 위한 프로토콜이 여기에 제시된다. CLARITY, See deep brain (SeeDB) 및 ScaleS와 같은 기존 방법은 종종 최대 30 %까지 크기 왜곡을 일으키는 반면, 벤질 알코올 / 벤질 벤조에이트 (BABB) 및 용매 제거 된 기관의 3D 이미징 (3DISCO)과 같은 기술은 형광 단백질(18)을 급냉시킬 수 있습니다. 이들 방법들 중 다수는 구조적 완전성을 갖는 조직을 클리어링하고 구상체(18)에 적용될 때 크기 및 구조를 왜곡하도록 설계된다. 상업적으로 이용 가능한 고가의 클리어링 솔루션을 사용하는 다른 프로토콜과는 달리, 이 프로토콜은 광학 선명도와 내인성 형광을 유지하고 크기 왜곡을 최소화하면서 쉽게 사용할 수 있는 소모품을 사용합니다. 아가로스-PBS 겔에 구상체를 내장하면 구상체에 대한 구조적 지지가 제공되며 클리어링 용액이 첨가될 때 삼투압 충격을 최소화할 수 있습니다. 이것은 약물 치료 후 깨지기 쉬운 구상체를 이미징 할 때 중요합니다. 이 광학 클리어링 방법은 이 프로토콜이 전체 조직 클리어링으로부터 적응되기 때문에 임의의 방법에 의해 형성된 구상체에 적합하다고 가정된다. 가정은 상이한 스페로이드 형성 방법에 의해 수득된 구상체에서의 유사성에 기초한다. 고정제의 선택은 스페로이드 크기뿐만 아니라 내인성 형광에도 영향을 줄 수 있습니다. 이 클리어링 방법은 중성 4% PFA 용액으로 고정된 구상체에 적합합니다. 다른 고정 장치와의 호환성을 확인하기 위해서는 추가 테스트가 필요합니다.
이 기술을 통해 다중 스페로이드를 다중 웰 플레이트에 동시에 장착할 수 있다는 점을 감안할 때, 24웰 플레이트당 최대 360개의 스페로이드 구조 정보가 필요한 정량적 분석 파이프라인에 매우 적합합니다. 자동화된 스테이지 및 플레이트 매핑 기능을 갖춘 현미경은 이미징을 덜 수동으로 만들 수 있습니다. 이 방법은 단면화보다 빠르고 쉽지만 현재 완전한 자동화에는 적합하지 않습니다. 그러나, 이 방법에 의해 획득된 이미지들은 자동화된 이미지 프로세싱(4,19)에 적합하며, 이 프로토콜을 사용하여 스페로이드가 장착될 수 있는 속도는 스페로이드 내부 구조(20,21,22)의 정량적 분석에 도움이 된다.
전체 구상체를 염색하기 위해, 항체 농도, 부피 및 인큐베이션 시간은 모든 항체에 대해 최적화되어야 한다. 가이드로서 튜브 당 구상체 수에 따라 권장되는 2D 면역 형광 항체 농도의 2.5x 및 항체 100-200 μL를 사용하십시오. 로터에있을 때 모든 구상체가 염색 용액으로 덮여 있는지 확인하십시오. 인큐베이션 시간은 구상체 및 항체의 크기 및 밀도를 포함하는 많은 인자에 의존하며, 16-72 h의 범위일 수 있다. 구상체 내에서 더 깊은 신호 검출을 허용하는 방법에도 불구하고, UV에 의해 여기된 형광단은 상당한 광 산란을 일으켜 낮은 신호 대 잡음비를 초래한다. 표적 단백질을 시각화하기 위해 형광단을 선택할 때는주의를 기울여야합니다. 예를 들어, 더 긴 파장의 형광단과 더 풍부한 단백질 또는 핵 염색을 더 짧은 파장의 형광단으로 덜 풍부하고 구조적인 단백질을 염색하면 최상의 결과를 얻을 수 있습니다. 마지막으로, 클리어 된 구상체는 괴사 성 코어의 산란으로 인한 광 손실을 여전히 보여 주며, 600 μm 구상체로 얻은 이미지의 y / z 차원에서 분명합니다 (그림 2C).
더 높은 NA 목표를 가진 더 높은 배율 이미징은이 프로토콜을 사용하여 구상체를 장착하고 클리어하면 가능하지만 목표의 작동 거리는 이미징 깊이를 제한합니다. 오일 침지 렌즈의 경우 최상의 결과를 얻으려면 RI가 1.51인 오일을 사용하는 것이 중요합니다.
요약하면, 아가로스-PBS 겔 임베디드 클리어링 방법은 일반적으로 이용가능한 소모품을 사용하여 구상체 내부 깊숙한 곳의 세포를 시각화할 수 있게 한다. 이 방법을 사용하여 장착 및 클리어된 스페로이드는 최소한의 크기 왜곡을 거치며 구조적 무결성을 유지하므로 내부 스페로이드 구조 및 후속 자동 정량화와 관련된 고품질 데이터를 수집할 수 있습니다.
The authors have nothing to disclose.
이 연구는 Translational Research Institute (TRI), Woolloongabba, QLD에서 수행되었습니다. TRI는 호주 정부의 보조금으로 지원됩니다. 뛰어난 기술 지원에 대해 TRI의 현미경 검사 핵심 시설의 직원들에게 감사드립니다. FUCCI 구축물을 제공해주신 일본 와코시 리켄 아츠시 미야와키 교수님, Meenhard Herlyn 교수님과 펜실베이니아 주 필라델피아 위스타 연구소의 패트리샤 브래포드 여사에게 세포주를 제공해 주신 것에 감사드립니다. C8161 냉동 절제 이미지를 제공해 주신 Loredana Spoerri 박사님께 감사드립니다.
이 작업은 N.K.H.: Australian Research Council (DP200100177) 및 Meehan Project Grant (021174 2017002565)에 대한 프로젝트 보조금으로 지원되었습니다.
#1.5 glass bottom 24-well plate | Celvis | P24-1.5H-N | |
500 µL clear PCR tubes | Sigma | HS4422 | |
Alexa Fluor 647 AffiniPure Donkey Anti-Mouse IgG (H+L) | Jackson Immuno research | 715-605-151 | Dilution used 1:500 |
Bovine serum albumin | Sigma | A7906 | Final concentration 2% w/v |
DAPI | Sigma | D9542-10MG | Final concentration 5 µg/mL |
Deionized water | MILLI Q | ||
Donkey anti-Rabbit IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 647 | Thermofisher | A-31573 | Dilution used 1:500 |
DRAQ7 | Thermofisher | D15106 | Dilution used 1:250 |
Heating block | Ratek | DBH10 | or similar equipment |
Hypoxyprobe Kits | Hypoxyprobe | HP1-1000Kit | Antibody dilution used 1:500 |
Low-melting agarose powder | Sigma | A9414 | Final concentration 2% w/v |
Microwave | Sharp | ||
N,N,N′,N′-Tetrakis(2-Hydroxypropyl)ethylenediamine | Sigma | 122262 | Final concentration 9% w/w |
NaCl | Sigma | S9888 | Final concentration 150 mM |
NaN3 | Sigma | S2002 | Final concentration 0.10% w/v |
p27 Kip1 (D69C12) XP | Cell Signalling technology | 3686S | Dilution used 1:500 |
Paraformaldehyde solution | Proscitech | C004 | Final concentration 4% w/v |
Phosphate Buffered Saline (PBS) | Thermofisher | 18912014 | Final concentration 1x |
Pipette | Eppendorf | ||
Quickspin minifuge | or similar equipment | ||
Roller | Ratek | BTR10-12V | or similar equipment |
Rotor | Ratek | RSM7DC | or similar equipment |
Shaker | Ratek | EOM5 | or similar equipment |
Sucrose | Sigma | S9378 | Final concentration 44% w/w |
Tris-HCl pH 7.4 | Sigma | T5941 | Final concentration 20 mM |
Triton X-100 | Sigma | X100 | Final concentration 0.10% v/v |
Triton X-100 | Sigma | X100 | Final concentration 0.1% v/v |
Tween 20 | Sigma | P1379 | Final concentration 0.1% v/v |
Urea | Sigma | U5379 | Final concentration 22% w/w |