本プロトコルは、量子ドットを用いて心臓組織切片中のタンパク質を免疫標識する方法を記載する。この技術は、あらゆるタンパク質の細胞内局在と発現を微細構造レベルで視覚化するための有用なツールを提供します。
細胞内局在は、適切な機能を描写し、特定のタンパク質の分子メカニズムを決定するために重要です。タンパク質の細胞内局在を決定するために、いくつかの定性的および定量的技術が使用される。タンパク質の細胞内局在を決定するための新しい技術の1つは、タンパク質の量子ドット(QD)を介した免疫標識とそれに続く透過型電子顕微鏡(TEM)によるイメージングです。QDは、結晶構造と高電子密度の二重の性質を持つ半導体ナノ結晶であり、電子顕微鏡に応用できます。この現在の方法では、心臓組織におけるQD-TEMを用いて、Sigma 1受容体(Sigmar1)タンパク質の細胞内局在を微細構造レベルで可視化しました。野生型マウスからの心臓組織切片の小さな立方体を3%グルタルアルデヒドで固定し、続いてオスミケートし、酢酸ウラニルで染色し、続いてエタノールおよびアセトンで順次脱水した。これらの脱水心臓組織切片を低粘度エポキシ樹脂に包埋し、厚さ500nmの薄切片に切断し、グリッド上に置き、続いて5%メタ過ヨウ素酸ナトリウムによる抗原アンマスキングを行い、続いて残留アルデヒドをグリシンでクエンチした。組織をブロックした後、一次抗体、ビオチン化二次抗体、およびストレプトアビジン結合QDで順次インキュベートしました。これらの染色切片をブロット乾燥し、TEMを用いて高倍率で画像化した。QD-TEM法により、心臓の微細構造レベルで Sigmar1タンパク質の細胞内局在を可視化することができました。これらの技術は、あらゆる臓器系における任意のタンパク質および細胞内局在の存在を視覚化するために使用することができる。
人体は、多くの身体機能を担う多くのタンパク質で構成されています。タンパク質の機能は、臓器および細胞小器官におけるそれらの局在に大きく依存する。細胞内分画、免疫蛍光、界面活性剤を介したタンパク質抽出など、いくつかの手法がタンパク質の細胞内局在を決定するために一般的に使用されています1,2。免疫蛍光色素を用いた顕微鏡検査は、これらの技術の中で最も広く使用されている方法です。しかしながら、この技術で用いられる蛍光色素は安定性が低く、光退色を起こしやすい3。その他の技術では、電子密度の高い重金属(金、フェリチン)または量子ドットナノ結晶でタンパク質を免疫標識し、透過型電子顕微鏡(TEM)を使用してそれらを視覚化することにより、超微細構造レベルでタンパク質を視覚化する高解像度顕微鏡法が含まれていました4,5。
QDは、制御可能なフォトルミネッセンス特性を持つ半導体金属化合物からなる半導体ナノ結晶であり、生体系において大きな意味を持っています3。QDナノ結晶は、ナノ結晶がナノ結晶の形成にカプセル化され、適切な安定性と機能を保証するコアシェル形式で製造されます。一般的に使用されるコアシェルナノ結晶の組み合わせは、CdSe / ZnS、CdSe / CdS CdSe / ZnSe、CdTe / CdS、CdTe / ZnS、およびCdTe / CdS / ZnS(コア/シェル/シェル)3です。これらのナノ結晶の組み合わせの中で、CdSe/ZnSおよびCdSe/CdSは最も活発に研究されており、二次抗体複合体として頻繁に使用されています3,6。これらのQDナノ粒子は、従来の蛍光色素とは異なる励起スペクトルと発光スペクトルを持つ蛍光特性も備えています。QDは、バルク価電子帯からの電子の励起を利用して、従来の蛍光色素と比較して高い蛍光量子収率を示します。半導体金属のナノ結晶配置により、QDを介した標識がより安定し、光退色に耐性があります6。さらに、QDのナノ結晶コアとその結晶構造により、異なるサイズのQDが広範囲の吸収スペクトルと非常に狭い発光ピークを持つことができます7。さらに、これらのQD粒子は、高い電子密度を生成するのに十分な大きさであり、透過型電子顕微鏡法を含む高分解能顕微鏡技術に有用です5,8,9。これらのQDナノ結晶は、異なる蛍光発光スペクトルおよび形状を有する複数のサイズで市販されており、複数の抗体による標識の優れた候補となっています10,11。
QD技術は、生細胞イメージング、細胞内の輸送機構の研究、タンパク質の拡散運動の膜輸送、細胞の機能的不均一性、細胞内オルガネラのマーキングなど、複数の機能特性により、生物学的研究において大きな重要性を誇っています3,12,13,14,15,16。.QDは、がん組織の標的化と検出、腫瘍の分子プロファイルと免疫状態の特徴付け、硝子体と網膜上膜の視覚化のための分子診断にも役立ちます3,17,18。さらに、QDは、眼に薬を送達することにより、光線力学療法および眼科異常を介して腫瘍悪性腫瘍を治療するための内科療法にも使用できます3,17,18,19。
これらの非常に有用なQDナノ結晶を用いて、本研究では、Sigma 1受容体(Sigmar1)という名前のタンパク質の細胞内局在を決定しました。Sigmar1は、遍在的に発現するマルチタスク分子シャペロンタンパク質です。異なる組織および器官におけるSigmar1の細胞内局在に焦点を当てた広範な研究は、分子機能を誘発する細胞および組織型特異的な細胞内局在を報告した20。異なる生化学的アプローチを用いた異なる細胞(神経細胞、光受容体、免疫細胞)および組織(肝臓および脳)において、小胞体(ER)、ミトコンドリア関連小胞体(MAM)、核膜、原形質膜、核膜、核、およびミトコンドリアにおけるSigmar1の局在が報告された。これらすべての研究にもかかわらず、心臓におけるSigmar1の細胞内局在は未知のままでした20。したがって、心臓組織におけるSigmar1の細胞内局在は、QD媒介免疫標識とそれに続くTEMイメージングを使用して決定されました。
本研究では、QDを介した免疫標識を使用して、Sigmar1の細胞内局在をはっきりと示しました。QDを用いて、ミトコンドリア膜、特にミトコンドリア内膜上のSigmar1の局在を心臓組織に描写した。さらに、Sigmar1は、図2A-Dに示すように、筋質/小胞体(S / ER)およびリソソーム上に超微細構造レベルで位置していることもわかりました。
このプロトコルの重要なステップは、高濃度のメタ過ヨウ素酸ナトリウム溶液を使用して、グルタルアルデヒドの固定および投与後に抗原をマスク解除するエッチングまたは抗原のマスク解除ステップです。このプロトコルでは、高濃度(5%)のメタ過ヨウ素酸ナトリウムを室温で30分間使用した。メタ過ヨウ素酸ナトリウムのインキュベーションの持続時間が長くなったり、濃度が高くなったりすると、構造の凝集、細胞小器官の膜定義の喪失、切片の穿孔が発生し、タンパク質や構造の視覚化が困難になるため、このステップでは特別な注意が必要です。あるいは、5%メタ過ヨウ素酸の代わりに、30分間の2段階の低濃度(3%)メタ過ヨウ素酸溶液を使用することもできます。研究は、このオプションが1ステップ30分のインキュベーションのための5%メタ過ヨウ素酸溶液と同様の結果を示すことを示した。しかしながら、30分間のインキュベーションのための3%メタ過ヨウ素酸溶液は、26、27、28のプロセスに対するより良い制御を提供する。当初、このプロトコルは、10%メタ過ヨウ素酸溶液で切片を30分間インキュベートすることを使用した。しかし、この濃度によって組織切片に生成される穿孔が多すぎるため、メタ過ヨウ素酸溶液の最終濃度とインキュベーション期間は先細りになり、30分間5%に最適化されました。
別のステップでは、グルタルアルデヒドによる固定時間の最適化が必要でした。組織の最適でない固定は不十分なQD標識をもたらしますが、組織の過剰固定はより高い非特異的標識をもたらします。したがって、タンパク質の適切かつ特異的な標識のための最適な組織固定レベルを決定し、滴定する際には、慎重な検討が必要です。心臓組織を用いたこの方法では、グルタルアルデヒドによる固定時間を24時間および48時間を時点として滴定した。両方の時点で固定された切片の染色画像に基づいて、24時間固定された切片がより良い結果を示すことがわかった。現在までに、QDナノ結晶は、525、565、585、605、655、および705nmを含む複数のサイズで入手可能である11,29。これらの量子ドットはそれぞれ独自の発光スペクトルを持ち、異なる波長で蛍光を発します。さらに、異なるサイズのこれらの市販の量子ドットは異なる形状を示します。たとえば、QD 525、565、および585は、サイズが異なる仮想球形ですが、QD 605、655、および705は不規則な長方形の形状です。これらの異なるQDナノ結晶のうち、QD525、565、および655は互いに容易に区別可能である11、29。発光スペクトルと形状のこれらの違いにより、QDはタンパク質のマルチラベリングや蛍光および電子顕微鏡による視覚化の優れた候補となります。この研究では、市販のQDであるQD 655を使用してSigmar1タンパク質を標識し、染色切片の非特異的バックグラウンドと区別しました。
高解像度顕微鏡におけるタンパク質標識のためのQDの別の対応物は、免疫金粒子である。イムノゴールド粒子は、従来、高解像度顕微鏡用のタンパク質の標識に使用されています。これらの金粒子は、量子ドットナノ結晶と比較して電子密度が高く、容易に識別できます。しかし、QDは、組織への浸透性、安定性と貯蔵寿命、および超微細構造成分の保持性が高いため、効率が向上し、タンパク質標識の候補として適しています4,5。QDはまた、光学顕微鏡と電子顕微鏡の両方で検出される独自の能力を備えており、イムノゴールド標識10よりもその価値を高めます。
このQD媒介免疫標識の1つの制限は、処理中の四酸化オスミウムの使用です。四酸化オスミウムは、電子密度が低く、コントラストの少ない生体膜構造の電子密度、導電率、およびコントラストを増加させるために使用されます5,30。しかしながら、四酸化オスミウムを瞬間的かつ不可逆的に使用すると、QD6で標識されたときに蛍光を生じる標本の特性を破壊する。これにより、蛍光顕微鏡でのQDの使用が制限されます。四酸化オスミウムの使用を省略した代替アプローチは、蛍光特性を保持する上で有利であり、したがってQD媒介免疫標識の二重適用において有利であろう。TEMの新しいモデルの中には、材料の元素組成を識別できるエネルギー分散型X線分析(EDX)システムを取り付けるオプションがあります。この研究のもう一つの制限は、EDXを使用したサンプルと画像分析の元素マッピングの欠如です。したがって、今後の研究では、元素組成を分析するためにQDスペクトルのEDX分析に焦点を当てる必要があります。
タンパク質のQD標識は、近年多くの注目を集めています。QDは、生物学的研究と医療治療の両方でいくつかのアプリケーションと利点を提供します。さらに多座配位子で包まれたQDは、量子収率を維持しながら安定性が向上した。さらに、これらの生物学的に有利な薬剤でQDをカプセル化すると、組織におけるバイオアベイラビリティも向上し、腫瘍の検出、生細胞イメージング、薬物送達、および組織イメージングにおける潜在的なアプリケーションの優れた候補になります3,31,32。
The authors have nothing to disclose.
この研究は、国立衛生研究所の助成金によってサポートされました:R01HL145753、R01HL145753-01S1、R01HL145753-03S1、およびR01HL152723;MSBへのLSUHSC-S CCDSフィニッシュライン賞、COVID-19研究賞、およびLARC研究賞。LSUHSC-Sマルコムファイスト心臓血管およびCSAへのAHAポスドクフェローシップ(20POST35210789);LSUHSC-SマルコムファイストRAへの博士課程前フェローシップ。
200 Mesh copper grid | Ted Pella | G200HH | |
6-month-old male mice with FVB/N background | Jackson Laboratory, Bar Harbor, ME | ||
Acetone 100% | Fisher Chemicals | A949 | |
Antibody diluent | Dako | S3022 | |
anti-Sigmar1 antibody | Cell Signaling | 61994S | |
Biotinylated goat anti-rabbit IgG antibody | Sigma Aldrich | B7389 | |
BSAc (10%) | Electron Microscopy Sciences | 25557 | |
Calcium chloride | Sigma Aldrich | C7902 | |
Cytoseal Xyl | Thermo fisher | 8312-4 | |
DER 732C36AA10:C33 | Electron Microscopy Sciences | 13010 | |
Dextrose | Sigma Aldrich | G7528 | |
Diamond Knife | Diatome | Histo; Ultra 450 | |
DMAE | Electron Microscopy Sciences | 13300 | |
Electron microscope | JEOL | JEOL-1400 Flash | |
ERL 4221 | Electron Microscopy Sciences | 15004 | |
Ethanol 100% | Fisher Chemicals | A405P | |
Glutaraldehyde 3% | Electron Microscopy Sciences | 16538-15 | |
Glycine | Alfa Aesar | A13816 | |
Hydrochloric acid | Fisher Scientific | SA56 | |
Micromolds | Ted Pella | 10505 | |
Microtome | Leica Microsystem | EM UC7 | |
Normal goat serum | Invitrogen | PCN5000 | |
NSA | Electron Microscopy Sciences | 19050 | |
Osmium tetroxide | Electron Microscopy Sciences | 19150 | |
Parafilm | Genesse Scientific | 16-101 | |
Potassium Chloride | Sigma Aldrich | P5655 | |
Potassium Phosphate monobasic | Sigma Aldrich | 71640 | |
Qdot 655 Streptavidin Conjugate | Invitrogen | Q10121MP | |
Sodium Acetate | Fisher Scientific | BP334 | |
Sodium Cacodylate | Electron Microscopy Sciences | 12300 | |
Sodium Chloride | Fisher Scientific | BP358 | |
Sodium metaperiodate | Sigma Aldrich | 71859 | |
Sodium Phosphate dibasic | Sigma Aldrich | P9541 | |
Surgical blade (size 10) | Aspen surgical | 371110 | |
TEM image software | AMT-V700 | AMT TEM imaging systems | |
TEM imaging camera | XR80 TEM series | AMT TEM imaging systems | |
Toluidine Blue O solution (0.5%) | Fisher Scientic | S25612 | |
Uranyl acetate | Polysciences | 21447 |