Das vorliegende Protokoll beschreibt eine Methode zur Immunmarkierung eines Proteins in den Herzgewebeschnitten unter Verwendung von Quantenpunkten. Diese Technik bietet ein nützliches Werkzeug, um die subzelluläre Lokalisation und Expression eines Proteins auf ultrastruktureller Ebene zu visualisieren.
Die subzelluläre Lokalisation ist entscheidend für die Beschreibung der richtigen Funktion und die Bestimmung der molekularen Mechanismen eines bestimmten Proteins. Mehrere qualitative und quantitative Techniken werden verwendet, um die subzelluläre Lokalisation von Proteinen zu bestimmen. Eine der aufkommenden Techniken zur Bestimmung der subzellulären Lokalisation eines Proteins ist die Quantenpunkt-(QD)-vermittelte Immunmarkierung eines Proteins, gefolgt von der Abbildung mit Transmissionselektronenmikroskopie (TEM). QD ist ein Halbleiter-Nanokristall mit einer doppelten Eigenschaft der kristallinen Struktur und der hohen Elektronendichte, was sie für die Elektronenmikroskopie anwendbar macht. Diese aktuelle Methode visualisierte die subzelluläre Lokalisation des Sigma-1-Rezeptors (Sigmar1) mittels QD-TEM im Herzgewebe auf ultrastruktureller Ebene. Kleine Würfel der Herzgewebeschnitte einer Wildtyp-Maus wurden in 3% Glutaraldehyd fixiert, anschließend osmiert, mit Uranylacetat gefärbt, gefolgt von sequentieller Dehydratisierung mit Ethanol und Aceton. Diese dehydrierten Herzgewebeschnitte wurden in niedrigviskose Epoxidharze eingebettet, in dünne Abschnitte von 500 nm Dicke geschnitten, auf das Gitter gelegt und anschließend einer Antigen-Demaskierung mit 5% Natriummetaperiodat unterzogen, gefolgt von der Abschreckung der Restaldehyde mit Glycin. Die Gewebe wurden blockiert, gefolgt von einer sequentiellen Inkubation in primären Antikörpern, biotinylierten sekundären Antikörpern und streptavidin-konjugierter QD. Diese gefärbten Abschnitte wurden getupft getrocknet und mit hoher Vergrößerung mit TEM abgebildet. Die QD-TEM-Technik ermöglichte die Visualisierung der subzellulären Lokalisation des Sigmar1-Proteins auf ultrastruktureller Ebene im Herzen. Diese Techniken können verwendet werden, um das Vorhandensein von Proteinen und subzellulären Lokalisationen in jedem Organsystem zu visualisieren.
Der menschliche Körper besteht aus vielen Proteinen, die für zahlreiche Körperfunktionen verantwortlich sind. Die Funktion von Proteinen hängt maßgeblich von ihrer Lokalisation im Organ und in den Zellorganellen ab. Verschiedene Techniken, einschließlich subzellulärer Fraktionierung, Immunfluoreszenz und detergensvermittelter Proteinextraktion, werden häufig verwendet, um die subzelluläre Lokalisation des Proteins zu bestimmen 1,2. Die Mikroskopie mit Immunfluoreszenzfarbstoff ist die am weitesten verbreitete Methode unter diesen Techniken. Die bei dieser Technik verwendeten Fluoreszenzfarbstoffe sind jedoch weniger stabil und anfällig für Photobleiche3. Andere Techniken beinhalteten hochauflösende Mikroskopie, um das Protein auf ultrastruktureller Ebene sichtbar zu machen, indem Proteine mit elektronendichten, Schwermetallen (Gold, Ferritin) oder Quantenpunkt-Nanokristallen immunisiert und anschließend mit Transmissionselektronenmikroskopie (TEM) sichtbar gemacht wurden4,5.
QD ist ein Halbleiter-Nanokristall, der aus Halbleitermetallverbindungen mit kontrollierbaren Photolumineszenzeigenschaften besteht, die in biologischen Systemen eine große Bedeutung haben3. QD-Nanokristalle werden in einem Kern-Schale-Format hergestellt, bei dem ein Nanokristall in die Bildung von Nanokristallen eingekapselt wird, um ihre ordnungsgemäße Stabilität und Funktion zu gewährleisten. Häufig verwendete Kern-Schale-Nanokristallkombinationen sind CdSe/ZnS, CdSe/CdS CdSe/ZnSe, CdTe/CdS, CdTe/ZnS und CdTe/CdS/ZnS (Kern/Schale/Schale)3. Unter diesen Nanokristallkombinationen werden CdSe/ZnS und CdSe/CdS am intensivsten untersucht und häufig als sekundäre Antikörperkonjugate 3,6 verwendet. Diese QD-Nanopartikel besitzen auch fluoreszierende Eigenschaften mit anderen Anregungs- und Emissionsspektren als herkömmliche Fluorophore. QD nutzt die Anregung von Elektronen aus dem Bulk-Valenzband, um im Vergleich zu herkömmlichen Fluorophoren höhere Fluoreszenzquantenausbeuten zu zeigen. Die Nanokristallanordnung von Halbleitermetallen macht QD-vermittelte Markierungen stabiler und resistenter gegen Photobleiche6. Darüber hinaus ermöglicht der Nanokristallkern in QD und seine kristalline Struktur QD unterschiedlicher Größe eine breite Palette von Absorptionsspektren und sehr enge Emissionspeaks7. Darüber hinaus sind diese QD-Partikel groß genug, um eine hohe Elektronendichte zu erzielen, was sie in hochauflösenden Mikroskopietechniken, einschließlich der Transmissionselektronenmikroskopie 5,8,9, nützlich macht. Diese QD-Nanokristalle sind auch kommerziell in mehreren Größen mit unterschiedlichen Fluoreszenzemissionsspektren und -formen erhältlich, was sie zu einem großartigen Kandidaten für die Markierung mit mehreren Antikörpernmacht 10,11.
Die QD-Technologie erlangte in der biologischen Forschung aufgrund ihrer vielfältigen funktionellen Eigenschaften große Bedeutung, einschließlich der Verwendung in der Bildgebung lebender Zellen, der Untersuchung von Transportmechanismen in der Zelle, des Membrantransports der Diffusionsbewegung des Proteins, der funktionellen Heterogenität von Zellen und der Markierung intrazellulärer Organellen 3,12,13,14,15,16 . QD ist auch nützlich in der molekularen Diagnostik für die gezielte und Erkennung von Krebsgewebe, die Charakterisierung des molekularen Profils und des Immunstatus des Tumors und die Visualisierung von Glaskörper- und Epiretinalmembranen 3,17,18. Darüber hinaus kann QD auch in medizinischen Therapien verwendet werden, um Tumormalignome durch photodynamische Therapie und ophthalmologische Anomalien zu behandeln, indem Medikamente an die Augen abgegebenwerden 3,17,18,19.
Unter Verwendung dieser hochnützlichen QD-Nanokristalle bestimmte die vorliegende Studie die subzelluläre Lokalisation eines Proteins namens Sigma-1-Rezeptor (Sigmar1). Sigmar1 ist ein ubiquitär exprimiertes multitasking-molekulares Chaperonprotein. Umfangreiche Studien, die sich auf die subzelluläre Lokalisation von Sigmar1 in verschiedenen Geweben und Organen konzentrierten, berichteten über eine zell- und gewebetypspezifische subzelluläre Lokalisation, die molekulare Funktionen auslöste20. In verschiedenen Zellen (neuronale, Photorezeptor- und Immunzellen) und Geweben (Leber und Gehirn) mit unterschiedlichen biochemischen Ansätzen berichteten Studien über die Lokalisation von Sigmar1 auf endoplasmatischem Retikulum (ER), Mitochondrien-assoziierter ER-Membran (MAM), Kernhülle, Plasmamembran, nukleoplasmatischem Retikulum, Kern und Mitochondrien. Trotz all dieser Studien blieb die subzelluläre Lokalisation von Sigmar1 im Herzen unbekannt20. Daher wurde die subzelluläre Lokalisation von Sigmar1 im Herzgewebe mittels QD-vermittelter Immunmarkierung und anschließender TEM-Bildgebung bestimmt.
In der vorliegenden Studie wurde QD-vermittelte Immunmarkierung verwendet, um die subzelluläre Lokalisation von Sigmar1 deutlich zu zeigen. Mit Hilfe von QD wurde die Lokalisation von Sigmar1 auf der mitochondrialen Membran, insbesondere der inneren Mitochondrienmembran, im Herzgewebe dargestellt. Darüber hinaus wurde festgestellt, dass Sigmar1 auch auf sarkoplasmatischen/endoplasmatischen Retikulum (S/ER) und Lysosomen auf ultrastruktureller Ebene lokalisiert ist, wie in Abbildung 2A-D gezeigt.
Ein kritischer Schritt in diesem Protokoll ist der Ätz- oder Antigen-Demaskierungsschritt unter Verwendung hochkonzentrierter Natriummetaperiodatlösung zur Demaskierung des Antigens nach Glutaraldehydfixierung und Osmierung. Dieses Protokoll verwendete eine einmalige Behandlung mit einer hohen Konzentration (5%) Natriummetaperiodat für 30 Minuten bei Raumtemperatur. In diesem Schritt ist besondere Vorsicht geboten, da eine längere Dauer oder höhere Konzentration für die Natriummetaperiodat-Inkubation zur Aggregation von Strukturen, zum Verlust der Membrandefinition für die Organellen führt und Perforationen im Abschnitt verursacht, was es schwierig macht, das Protein oder die Struktur zu visualisieren. Alternativ kann anstelle von 5% Metaperiodat auch eine niedrigere Konzentration von (3%) Metaperiodatlösung in zwei Schritten für 30 min verwendet werden. Studien haben gezeigt, dass diese Option ähnliche Ergebnisse wie bei einer 5% igen Metaperiodatlösung für eine einstufige 30-minütige Inkubation zeigt. Eine 3% ige Metaperiodatlösung für 30 Minuten Inkubation für zwei Mal bietet jedoch eine bessere Kontrolle über den Prozess26,27,28. Anfangs verwendete dieses Protokoll die Inkubation der Abschnitte mit 10% iger Metaperiodatlösung für 30 min. Aufgrund zu vieler Perforationen, die durch diese Konzentration im Gewebeschnitt entstehen, wurde jedoch die Endkonzentration und Inkubationsdauer der Metaperiodatlösung reduziert und für 30 min auf 5% optimiert.
Ein weiterer Schritt erforderte die Optimierung der Fixierungszeit mit Glutaraldehyd. Eine suboptimale Fixierung von Geweben führt zu einer unzureichenden QD-Markierung, während eine Überfixierung von Geweben zu einer höheren unspezifischen Markierung führt. Daher muss bei der Bestimmung und Titration eines optimalen Gewebefixierungsgrades für eine korrekte und spezifische Markierung von Proteinen sorgfältig abgewogen werden. Bei dieser Methode mit Herzgewebe wurde die Fixierungszeit mit Glutaraldehyd unter Verwendung von 24 h und 48 h als Zeitpunkte titriert. Basierend auf den Färbebildern der Abschnitte, die für beide Zeitpunkte festgelegt wurden, wurde festgestellt, dass Abschnitte, die für 24 Stunden fixiert waren, bessere Ergebnisse zeigten. Bis heute sind QD-Nanokristalle in verschiedenen Größen erhältlich, darunter 525, 565, 585, 605, 655 und 705 nm11,29. Jede dieser QD hat ihre eigenen Emissionsspektren und emittiert Fluoreszenz bei verschiedenen Wellenlängen. Darüber hinaus weisen diese kommerziell erhältlichen QDs unterschiedlicher Größe unterschiedliche Formen auf; Zum Beispiel sind QD 525, 565 und 585 praktisch kugelförmig mit unterschiedlichen Größen, während QD 605, 655 und 705 unregelmäßig länglich geformt sind. Von diesen verschiedenen QD-Nanokristallen sind QD 525, 565 und 655 leicht voneinander zu unterscheiden11,29. Diese Unterschiede in Emissionsspektren und -formen machen QD zu einem großartigen Kandidaten für die Multi-Markierung von Proteinen und die Visualisierung durch Fluoreszenz- und Elektronenmikroskopie. In dieser Studie wurde eine kommerziell erhältliche QD, QD 655, verwendet, um das Sigmar1-Protein zu markieren, um es von jedem unspezifischen Hintergrund in den gefärbten Abschnitten zu unterscheiden.
Ein weiteres Gegenstück zur QD für die Proteinmarkierung in der hochauflösenden Mikroskopie ist das Immunogoldpartikel. Die Immungoldpartikel werden traditionell verwendet, um Proteine für die hochauflösende Mikroskopie zu markieren. Diese Goldpartikel sind sehr elektronendicht und im Vergleich zu QD-Nanokristallen leicht identifizierbar. QD zeigt jedoch eine bessere Effizienz mit besserer Penetration in Gewebe, höherer Stabilität und Haltbarkeit und besserer Retention ultrastruktureller Komponenten, was sie zu einem besseren Kandidaten für die Proteinmarkierung macht 4,5. QD hat auch eine einzigartige Fähigkeit, sowohl durch Licht- als auch durch Elektronenmikroskopie nachgewiesen zu werden, was seinen Wert gegenüber der Immunogold-Markierung10 erhöht.
Eine Einschränkung dieser QD-vermittelten Immunmarkierung ist die Verwendung von Osmiumtetroxid während der Verarbeitung. Osmiumtetroxid wird verwendet, um die Elektronendichte, Leitfähigkeit und den Kontrast von ansonsten weniger elektronendichten und weniger kontrastierenden biologischen Membranstrukturen zu erhöhen 5,30. Die Verwendung von Osmiumtetroxid zerstört jedoch sofort und irreversibel die Eigenschaft der Probe, Fluoreszenz zu erzeugen, wenn sie mit QD6 markiert wird. Dies schränkt die Verwendung von QD in der Fluoreszenzmikroskopie ein. Ein alternativer Ansatz, der auf die Verwendung von Osmiumtetroxid verzichtet, wird vorteilhaft sein, um die fluoreszierenden Eigenschaften und damit die doppelte Anwendung der QD-vermittelten Immunmarkierung beizubehalten. Einige der neueren Modelle von TEM haben die Möglichkeit, das energiedispersive Röntgenanalysesystem (EDX) anzubringen, das die Identifizierung der Elementzusammensetzung von Materialien ermöglicht. Eine weitere Einschränkung der Studie ist das Fehlen einer Elementkartierung einer Probe und Bildanalyse mittels EDX. Daher sollten sich zukünftige Studien auf die EDX-Analyse der QD-Spektren konzentrieren, um die elementare Zusammensetzung zu analysieren.
Die QD-Markierung von Proteinen hat in letzter Zeit viel Aufmerksamkeit erregt. QD bietet mehrere Anwendungen und Vorteile sowohl in der biologischen Forschung als auch in der medizinischen Therapeutika. QD, das zusätzlich mit polyzähnigen Liganden umwickelt ist, zeigt eine erhöhte Stabilität, die die Quantenausbeute beibehält. Darüber hinaus erhöht die Verkapselung von QD mit diesen biogünstigen Wirkstoffen auch seine Bioverfügbarkeit in Geweben, was es zu einem guten Kandidaten für eine mögliche Anwendung bei der Erkennung von Tumoren, der Bildgebung lebender Zellen, der Wirkstoffabgabe und der Gewebebildgebung macht 3,31,32.
The authors have nothing to disclose.
Diese Arbeit wurde durch die Zuschüsse der National Institutes of Health unterstützt: R01HL145753, R01HL145753-01S1, R01HL145753-03S1 und R01HL152723; LSUHSC-S CCDS Finish Line Award, COVID-19 Research Award und LARC Research Award an MSB; LSUHSC-S Malcolm Feist Herz-Kreislauf- und AHA-Postdoc-Stipendium für CSA (20POST35210789); und LSUHSC-S Malcolm Feist Pre-doctoral Fellowship zu RA.
200 Mesh copper grid | Ted Pella | G200HH | |
6-month-old male mice with FVB/N background | Jackson Laboratory, Bar Harbor, ME | ||
Acetone 100% | Fisher Chemicals | A949 | |
Antibody diluent | Dako | S3022 | |
anti-Sigmar1 antibody | Cell Signaling | 61994S | |
Biotinylated goat anti-rabbit IgG antibody | Sigma Aldrich | B7389 | |
BSAc (10%) | Electron Microscopy Sciences | 25557 | |
Calcium chloride | Sigma Aldrich | C7902 | |
Cytoseal Xyl | Thermo fisher | 8312-4 | |
DER 732C36AA10:C33 | Electron Microscopy Sciences | 13010 | |
Dextrose | Sigma Aldrich | G7528 | |
Diamond Knife | Diatome | Histo; Ultra 450 | |
DMAE | Electron Microscopy Sciences | 13300 | |
Electron microscope | JEOL | JEOL-1400 Flash | |
ERL 4221 | Electron Microscopy Sciences | 15004 | |
Ethanol 100% | Fisher Chemicals | A405P | |
Glutaraldehyde 3% | Electron Microscopy Sciences | 16538-15 | |
Glycine | Alfa Aesar | A13816 | |
Hydrochloric acid | Fisher Scientific | SA56 | |
Micromolds | Ted Pella | 10505 | |
Microtome | Leica Microsystem | EM UC7 | |
Normal goat serum | Invitrogen | PCN5000 | |
NSA | Electron Microscopy Sciences | 19050 | |
Osmium tetroxide | Electron Microscopy Sciences | 19150 | |
Parafilm | Genesse Scientific | 16-101 | |
Potassium Chloride | Sigma Aldrich | P5655 | |
Potassium Phosphate monobasic | Sigma Aldrich | 71640 | |
Qdot 655 Streptavidin Conjugate | Invitrogen | Q10121MP | |
Sodium Acetate | Fisher Scientific | BP334 | |
Sodium Cacodylate | Electron Microscopy Sciences | 12300 | |
Sodium Chloride | Fisher Scientific | BP358 | |
Sodium metaperiodate | Sigma Aldrich | 71859 | |
Sodium Phosphate dibasic | Sigma Aldrich | P9541 | |
Surgical blade (size 10) | Aspen surgical | 371110 | |
TEM image software | AMT-V700 | AMT TEM imaging systems | |
TEM imaging camera | XR80 TEM series | AMT TEM imaging systems | |
Toluidine Blue O solution (0.5%) | Fisher Scientic | S25612 | |
Uranyl acetate | Polysciences | 21447 |