يصف البروتوكول الحالي طريقة لوضع العلامات المناعية على البروتين في أقسام أنسجة القلب باستخدام النقاط الكمومية. توفر هذه التقنية أداة مفيدة لتصور توطين أي بروتين تحت خلوي والتعبير عنه على مستوى البنية الفائقة.
يعد التوطين تحت الخلوي أمرا بالغ الأهمية لتحديد الوظيفة المناسبة وتحديد الآليات الجزيئية لبروتين معين. يتم استخدام العديد من التقنيات النوعية والكمية لتحديد التوطين تحت الخلوي للبروتينات. إحدى التقنيات الناشئة في تحديد التوطين تحت الخلوي للبروتين هي وضع العلامات المناعية بوساطة النقاط الكمومية (QD) للبروتين متبوعا بتصويرها باستخدام المجهر الإلكتروني النافذ (TEM). QD عبارة عن بلورة نانوية لأشباه الموصلات ذات خاصية مزدوجة للبنية البلورية وكثافة الإلكترون العالية ، مما يجعلها قابلة للتطبيق على المجهر الإلكتروني. تصور هذه الطريقة الحالية التوطين تحت الخلوي لبروتين مستقبلات سيغما 1 (Sigmar1) باستخدام QD-TEM في أنسجة القلب على مستوى البنية الفائقة. تم تثبيت مكعبات صغيرة من أقسام أنسجة القلب من فأر من النوع البري في 3٪ جلوتارالدهيد ، ثم تناضح لاحقا ، ملطخا بأسيتات اليورانيل ، يليه الجفاف المتسلسل مع الإيثانول والأسيتون. تم تضمين أقسام أنسجة القلب المجففة هذه في راتنجات الايبوكسي منخفضة اللزوجة ، مقطعة إلى أقسام رقيقة بسمك 500 نانومتر ، ووضعت على الشبكة ، ثم تعرضت بعد ذلك لكشف المستضد بنسبة 5٪ ميتادوريت الصوديوم ، تليها تبريد الألدهيدات المتبقية مع الجلايسين. تم حظر الأنسجة ، تليها الحضانة المتسلسلة في الجسم المضاد الأولي ، والجسم المضاد الثانوي البيوتينيل ، و QD المترافق بالستربتافيدين. تم تجفيف هذه المقاطع الملطخة وتصويرها بتكبير عال باستخدام TEM. سمحت تقنية QD-TEM بتصور التوطين تحت الخلوي لبروتين Sigmar1 على مستوى البنية التحتية في القلب. يمكن استخدام هذه التقنيات لتصور وجود أي توطين بروتيني وتحت خلوي في أي جهاز عضوي.
يتكون جسم الإنسان من العديد من البروتينات المسؤولة عن العديد من وظائف الجسم. تعتمد وظيفة البروتينات إلى حد كبير على توطينها في الأعضاء والعضيات الخلوية. تستخدم العديد من التقنيات ، بما في ذلك التجزئة تحت الخلوية ، والتألق المناعي ، واستخراج البروتين بوساطة المنظفات ، بشكل شائع لتحديد توطين البروتين تحت الخلوي 1,2. الفحص المجهري باستخدام صبغة الفلورسنت المناعية هو الطريقة الأكثر استخداما بين هذه التقنيات. ومع ذلك ، فإن الأصباغ الفلورية المستخدمة في هذه التقنية أقل استقرارا وعرضة للتبييض الضوئي3. تضمنت التقنيات الأخرى الفحص المجهري عالي الدقة لتصور البروتين على مستوى البنية التحتية عن طريق وضع علامات مناعية على البروتينات ذات الإلكترونات الثقيلة والمعادن الثقيلة (الذهب والفيريتين) أو بلورات النقاط الكمومية النانوية وتليها تصورها باستخدام المجهر الإلكتروني النافذ (TEM)4,5.
QD عبارة عن بلورة نانوية أشباه الموصلات تتكون من مركبات معدنية أشباه الموصلات ذات خصائص تلألؤ ضوئي يمكن التحكم فيها ولها أهمية كبيرة في الأنظمة البيولوجية3. تصنع بلورات QD النانوية في شكل غلاف أساسي حيث يتم تغليف بلورة نانوية في تكوين بلورات نانوية لضمان استقرارها وعملها بشكل صحيح. تركيبة البلورات النانوية ذات القشرة الأساسية شائعة الاستخدام هي CdSe / ZnS و CdSe / CdS CdSe / ZnSe و CdTe / CdS و CdTe / ZnS و CdTe / CdS / ZnS (core / shell / shell) 3. من بين هذه المجموعات البلورية النانوية ، تتم دراسة CdSe / ZnS و CdSe / CdS بقوة أكبر وتستخدم بشكل متكرر كاتحادات ثانوية للأجسام المضادة 3,6. تمتلك هذه الجسيمات النانوية QD أيضا خصائص فلورية ذات أطياف إثارة وانبعاث مختلفة عن الفلوروفورات التقليدية. يستخدم QD إثارة الإلكترونات من نطاق التكافؤ السائب لإظهار عوائد كمية مضان أعلى مقارنة بالفلوروفورات التقليدية. يجعل ترتيب البلورات النانوية لمعادن أشباه الموصلات وضع العلامات بوساطة QD أكثر استقرارا ومقاومة للتبييض الضوئي6. بالإضافة إلى ذلك ، فإن قلب البلورات النانوية في QD وهيكله البلوري يسمح ل QD بأحجام مختلفة بالحصول على مجموعة واسعة من أطياف الامتصاص وقمم الانبعاث الضيقة جدا7. علاوة على ذلك ، فإن جسيمات QD هذه كبيرة بما يكفي لإنتاج كثافة إلكترونية عالية ، مما يجعلها مفيدة في تقنيات الفحص المجهري عالية الدقة ، بما في ذلك المجهر الإلكتروني النافذ5،8،9. تتوفر هذه البلورات النانوية QD أيضا تجاريا بأحجام متعددة مع أطياف وأشكال انبعاث مضان مختلفة ، مما يجعلها مرشحا رائعا لوضع العلامات بأجسام مضادة متعددة10,11.
جذبت تقنية QD أهمية كبيرة في البحوث البيولوجية بسبب الخصائص الوظيفية المتعددة ، بما في ذلك استخدامها في تصوير الخلايا الحية ، ودراسة آليات النقل في الخلية ، والنقل الغشائي لحركة انتشار البروتين ، وعدم التجانس الوظيفي للخلايا ، ووضع علامات على العضيات داخل الخلايا3،12،13،14،15،16 . QD مفيد أيضا في التشخيص الجزيئي لاستهداف واكتشاف الأنسجة السرطانية ، وتوصيف الملف الجزيئي للورم والحالة المناعية ، وتصور الجسم الزجاجي والأغشية فوق الشبكية3،17،18. بالإضافة إلى ذلك ، يمكن أيضا استخدام QD في العلاجات الطبية لعلاج الأورام الخبيثة عن طريق العلاج الضوئي الديناميكي وتشوهات العيون عن طريق توصيل الأدوية إلى العيون3،17،18،19.
باستخدام هذه البلورات النانوية QD المفيدة للغاية ، حددت الدراسة الحالية التوطين تحت الخلوي لبروتين يسمى مستقبل Sigma 1 (Sigmar1). Sigmar1 هو بروتين مرافقون جزيئي متعدد المهام يتم التعبير عنه في كل مكان. أفادت الدراسات المكثفة التي تركز على توطين Sigmar1 تحت الخلوي في الأنسجة والأعضاء المختلفة عن توطين تحت خلوي محدد من نوع الخلية والأنسجة مما يؤدي إلى الوظيفة الجزيئية20. في الخلايا المختلفة (الخلايا العصبية والمستقبلات الضوئية والخلايا المناعية) والأنسجة (الكبد والدماغ) باستخدام مناهج كيميائية حيوية مختلفة ، أبلغت الدراسات عن توطين Sigmar1 على الشبكة الإندوبلازمية (ER) ، وغشاء ER المرتبط بالميتوكوندريا (MAM) ، والغلاف النووي ، وغشاء البلازما ، والشبكة النووية ، والنواة ، والميتوكوندريا. على الرغم من كل هذه الدراسات ، ظل التوطين تحت الخلوي ل Sigmar1 في القلب غير معروف20. لذلك ، تم تحديد التوطين تحت الخلوي ل Sigmar1 في أنسجة القلب باستخدام الوسم المناعي بوساطة QD متبوعا بتصوير TEM.
في الدراسة الحالية ، تم استخدام الوسم المناعي بوساطة QD لإظهار التوطين تحت الخلوي ل Sigmar1 بشكل مميز. باستخدام QD ، تم تصوير توطين Sigmar1 على غشاء الميتوكوندريا ، وخاصة غشاء الميتوكوندريا الداخلي ، في أنسجة القلب. بالإضافة إلى ذلك ، تم العثور على Sigmar1 أيضا على الشبكة الساركوبلازمية / الإندوبلازمية (S / ER) والليزوزومات على مستوى البنية التحتية ، كما هو موضح في الشكل 2A-D.
الخطوة الحاسمة في هذا البروتوكول هي خطوة النقش أو كشف المستضد باستخدام محلول ميتادوريات الصوديوم عالي التركيز للكشف عن المستضد بعد تثبيت الجلوتارالدهيد والتناضح. استخدم هذا البروتوكول علاجا واحدا بتركيز عال (5٪) من ميتافورات الصوديوم لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. هناك حاجة إلى مزيد من العناية في هذه الخطوة لأن مدة أطول أو تركيز أعلى لحضانة ميتافلورات الصوديوم سيؤدي إلى تجميع الهياكل ، وفقدان تعريف الغشاء للعضيات ، ويسبب ثقوبا في القسم ، مما يجعل من الصعب تصور البروتين أو الهيكل. بدلا من ذلك ، يمكن أيضا استخدام تركيز أقل من محلول ميتافورمات (3٪) في خطوتين لمدة 30 دقيقة بدلا من 5٪ ميتادوريت. أظهرت الدراسات أن هذا الخيار يظهر نتائج مماثلة كما هو الحال مع محلول 5٪ metaperiodate لحضانة من خطوة واحدة مدتها 30 دقيقة. ومع ذلك ، فإن حل metaperiodate بنسبة 3٪ لمدة 30 دقيقة من الحضانة لمرتين يوفر تحكما أفضل في العملية26،27،28. في البداية ، استخدم هذا البروتوكول حضانة الأقسام بمحلول metaperiodate بنسبة 10٪ لمدة 30 دقيقة. ومع ذلك ، نظرا لكثرة الثقوب التي تم إنشاؤها في قسم الأنسجة بواسطة هذا التركيز ، تم تقليل التركيز النهائي ومدة الحضانة لمحلول metaperiodate وتحسينها إلى 5٪ لمدة 30 دقيقة.
خطوة أخرى تتطلب تحسين وقت التثبيت مع الجلوتارالدهيد. يؤدي التثبيت دون المستوى الأمثل للأنسجة إلى عدم كفاية وضع علامات QD ، في حين أن التثبيت المفرط للأنسجة يؤدي إلى وضع علامات غير محددة أعلى. لذلك ، يجب النظر بعناية في تحديد ومعايرة المستوى الأمثل لتثبيت الأنسجة لوضع العلامات المناسبة والمحددة للبروتينات. في هذه الطريقة باستخدام أنسجة القلب ، تمت معايرة وقت التثبيت مع الجلوتارالدهيد باستخدام 24 ساعة و 48 ساعة كنقاط زمنية. استنادا إلى صور التلوين للأقسام الثابتة لكل من النقاط الزمنية ، وجد أن الأقسام الثابتة لمدة 24 ساعة أظهرت نتائج أفضل. حتى الآن ، تتوفر بلورات QD النانوية بأحجام متعددة ، بما في ذلك 525 و 565 و 585 و 605 و 655 و 705 نانومتر11,29. كل من هذه QD لها أطياف الانبعاث الخاصة بها وتنبعث منها مضان بأطوال موجية مختلفة. بالإضافة إلى ذلك ، تعرض QDs المتاحة تجاريا بأحجام مختلفة أشكالا مختلفة. على سبيل المثال ، QD 525 و 565 و 585 كروية تقريبا بأحجام مختلفة ، في حين أن QD 605 و 655 و 705 مستطيلة الشكل غير منتظمة. من بين هذه البلورات النانوية المختلفة QD ، يمكن تمييز QD 525 و 565 و 655 بسهولة عن بعضها البعض11,29. هذه الاختلافات في أطياف الانبعاث والأشكال تجعل QD مرشحا رائعا لوضع العلامات المتعددة للبروتينات والتصور عن طريق التألق والمجهر الإلكتروني. في هذه الدراسة ، تم استخدام QD المتاح تجاريا ، QD 655 ، لتسمية بروتين Sigmar1 لتمييزه عن أي خلفية غير محددة في الأقسام الملطخة.
نظير آخر من QD لوضع العلامات على البروتين في الفحص المجهري عالي الدقة هو جسيم immunogold. تستخدم جزيئات الذهب المناعي تقليديا لتسمية البروتينات للفحص المجهري عالي الدقة. جزيئات الذهب هذه كثيفة الإلكترون ويمكن التعرف عليها بسهولة مقارنة بالبلورات النانوية QD. ومع ذلك ، يظهر QD كفاءة أفضل مع اختراق أفضل في الأنسجة ، واستقرار أعلى ومدة صلاحية ، واحتفاظ أفضل بمكونات البنية التحتية ، مما يجعلها مرشحا أفضل لوضع العلامات على البروتين 4,5. يتمتع QD أيضا بقدرة فريدة على اكتشافه بواسطة كل من المجهر الضوئي والإلكتروني ، مما يضيف إلى قيمته على ملصق immunogold10.
أحد قيود هذا الوسم المناعي بوساطة QD هو استخدام رابع أكسيد الأوزميوم أثناء المعالجة. يستخدم رابع أكسيد الأوزميوم لزيادة كثافة الإلكترون والتوصيل والتباين لهياكل الأغشية البيولوجية الأقل كثافة للإلكترون والأقل تباينا 5,30. ومع ذلك ، فإن استخدام رابع أكسيد الأوزميوم على الفور وبشكل لا رجعة فيه يدمر خاصية العينة لإنشاء مضان عند وضع علامة QD6. هذا يحد من استخدام QD في الفحص المجهري الفلوري. سيكون النهج البديل الذي يحذف استخدام رابع أكسيد الأوزميوم مفيدا في الاحتفاظ بخصائص الفلورسنت وبالتالي التطبيق المزدوج للوسم المناعي بوساطة QD. تحتوي بعض الطرز الأحدث من TEM على خيار إرفاق نظام تحليل الأشعة السينية المشتتة للطاقة (EDX) الذي يسمح بتحديد التركيب الأولي للمواد. ومن القيود الأخرى للدراسة عدم وجود رسم خرائط عنصري لعينة وتحليل الصور باستخدام EDX. لذلك ، يجب أن تركز الدراسات المستقبلية على تحليل EDX لأطياف QD لتحليل تكوين العنصر.
اكتسب وضع العلامات QD للبروتينات الكثير من الاهتمام في الآونة الأخيرة. تقدم QD العديد من التطبيقات والمزايا في كل من البحوث البيولوجية والعلاجات الطبية. بالإضافة إلى ذلك ، يتم لف QD برباط متعدد الأسنان يظهر ثباتا متزايدا يحافظ على العائد الكمومي. علاوة على ذلك ، فإن تغليف QD بهذه العوامل الحيوية المواتية يزيد أيضا من توافره البيولوجي في الأنسجة مما يجعله مرشحا جيدا للتطبيق المحتمل في الكشف عن الأورام وتصوير الخلايا الحية وتوصيل الأدوية وتصوير الأنسجة3،31،32.
The authors have nothing to disclose.
تم دعم هذا العمل من خلال منح المعاهد الوطنية للصحة: R01HL145753 و R01HL145753-01S1 و R01HL145753-03S1 و R01HL152723 ؛ جائزة خط النهاية LSUHSC-S CCDS ، وجائزة أبحاث COVID-19 ، وجائزة أبحاث LARC ل MSB ؛ زمالة LSUHSC-S Malcolm Feist للقلب والأوعية الدموية وزمالة AHA لما بعد الدكتوراه إلى CSA (20POST35210789) ؛ وزمالة LSUHSC-S Malcolm Feist لما قبل الدكتوراه إلى RA.
200 Mesh copper grid | Ted Pella | G200HH | |
6-month-old male mice with FVB/N background | Jackson Laboratory, Bar Harbor, ME | ||
Acetone 100% | Fisher Chemicals | A949 | |
Antibody diluent | Dako | S3022 | |
anti-Sigmar1 antibody | Cell Signaling | 61994S | |
Biotinylated goat anti-rabbit IgG antibody | Sigma Aldrich | B7389 | |
BSAc (10%) | Electron Microscopy Sciences | 25557 | |
Calcium chloride | Sigma Aldrich | C7902 | |
Cytoseal Xyl | Thermo fisher | 8312-4 | |
DER 732C36AA10:C33 | Electron Microscopy Sciences | 13010 | |
Dextrose | Sigma Aldrich | G7528 | |
Diamond Knife | Diatome | Histo; Ultra 450 | |
DMAE | Electron Microscopy Sciences | 13300 | |
Electron microscope | JEOL | JEOL-1400 Flash | |
ERL 4221 | Electron Microscopy Sciences | 15004 | |
Ethanol 100% | Fisher Chemicals | A405P | |
Glutaraldehyde 3% | Electron Microscopy Sciences | 16538-15 | |
Glycine | Alfa Aesar | A13816 | |
Hydrochloric acid | Fisher Scientific | SA56 | |
Micromolds | Ted Pella | 10505 | |
Microtome | Leica Microsystem | EM UC7 | |
Normal goat serum | Invitrogen | PCN5000 | |
NSA | Electron Microscopy Sciences | 19050 | |
Osmium tetroxide | Electron Microscopy Sciences | 19150 | |
Parafilm | Genesse Scientific | 16-101 | |
Potassium Chloride | Sigma Aldrich | P5655 | |
Potassium Phosphate monobasic | Sigma Aldrich | 71640 | |
Qdot 655 Streptavidin Conjugate | Invitrogen | Q10121MP | |
Sodium Acetate | Fisher Scientific | BP334 | |
Sodium Cacodylate | Electron Microscopy Sciences | 12300 | |
Sodium Chloride | Fisher Scientific | BP358 | |
Sodium metaperiodate | Sigma Aldrich | 71859 | |
Sodium Phosphate dibasic | Sigma Aldrich | P9541 | |
Surgical blade (size 10) | Aspen surgical | 371110 | |
TEM image software | AMT-V700 | AMT TEM imaging systems | |
TEM imaging camera | XR80 TEM series | AMT TEM imaging systems | |
Toluidine Blue O solution (0.5%) | Fisher Scientic | S25612 | |
Uranyl acetate | Polysciences | 21447 |