肺炎の治安を評価するための実験モデル

この研究に記載されているすべての動物プロトコルは、ジョンズホプキンス大学医学部の施設動物管理および使用委員会(ACUC)によって、動物プロトコルMO21M160が承認されました。さらに、実験は、動物研究に関する機関、州、および連邦の規制に従って行われました。 注意:以下に説明するすべてのプロトコルの複製は、バイオセーフティキャビネットの下にあるすべての機関BSL-2ガイドラインに従って、バイオセーフティレベル2(BSL-2)キャビネットで実行する必要があります。 1. 市販のループからのバクテリアストックのめっき 注:このプロトコルは、プロバイダーから取得したカルティループから始めて、 Spn (ATCC 49619)および Kpn (ATCC 43816)の細菌ストックの増殖に使用できます(詳細については 、材料の表 を参照)。 5%ヒツジ血液寒天培地プレートをインキュベーターで37°Cで15分間温めます。この目的のために、細胞インキュベーターを使用することができる。 フードの下で、細菌の接種ループからシースを取り外し、ジグザグパターンに従って寒天プレートに縞模様を描きながら慎重に広げます。別のプレートを複製として使用して、この手順を繰り返します。同じループで最大5枚のプレートにストリークできます。 プレートを37°Cで一晩インキュベートし、最適な細菌増殖を実現します。3日間毎日バクテリアを通過させます。血液寒天プレートを37°Cで15分間温め、使い捨ての接種ループを使用して最初の寒天プレートから15〜20コロニーを採取し、それらを新しい予熱した寒天プレートに広げます。プレートに適切なラベルを付けます。 2.将来の使用のためのバクテリアの成長と保管 3日後、縞模様のループで血液寒天プレートから最大30コロニーをピックアップし、トッドヒューイットブロス(THブロス)を含む250mLフラスコに直接入れます。37°Cでインキュベートし、250rpmで振とうし、5%CO2 で約4時間。 OD620nm が0.3に達するまで、15分ごとにアリコートを服用して測定します。これはmLあたり約3 x 108 コロニー形成単位(CFU)に相当します。 新しいバクテリアストック1mLをすぐに2mLの極低温バイアルに分注します。分注したばかりのバイアルを液体窒素で5分間急速凍結します。バクテリアのアリコートを-80°Cの冷凍庫で保存します(バイアルは効力を失うまで最大6〜8か月間使用できます)。 7日間の凍結後、アリコートは動物実験に使用できます。したがって、細菌の新しい濃度を決定します。 3. 気管内注入のための細菌融解 血液寒天プレートをシェーカーで37°Cで10分間温めます。新しいストックバイアルの1つを冷凍庫から取り出し、37°Cの水浴で約2分間穏やかに攪拌して解凍します。Oリングやキャップに温水で触れないでください。 血液寒天プレートにプレートを載せて、細菌のコロニーを手動でカウントします。1 x 10-6 希釈を行い、予熱した血液寒天プレートで最後の希釈から 200 μL をプレート化します。これを重複して行います。 プレートを37°Cで一晩インキュベートし、細菌の最適な増殖を実現します。翌日、次の式を適用して新しい細菌濃度を決定します:CFU/mL = (コロニー数 x 希釈係数) / ストックプレートの量 4. 生きた細菌の気管内注入 注:このプロトコルは、気管内に50μLの容量を注入するように最適化されています。バクテリアストックは、最大6〜9か月間保存できます。各バイアルに細菌CFUが混入していることを確認するには、各実験の前に必ずプレートを装着し、上記のように細菌ストックCFUを計算し、その後の希釈にはTHブロスを使用してください。 注意: バイオセーフティキャビネットの下で、滅菌済みの手術器具を使用してげっ歯類の生存手順を実行します。 100 mg / kgのケタミンと2.5 mg / kgのアセチルプロマジンを腹腔内に注射してマウスに麻酔をかけます。.一度に注入するマウスの数だけ繰り返します。注:マウスは、動物の取り扱いを容易にするためにイソフルランにさらされることができます。ただし、動物に大きな苦痛を与えることなく腹腔内麻酔薬を注射できる経験豊富なハンドラーは、イソフルランへの曝露を回避できます。注入するマウスの数は、外科医の専門知識によって異なります。 すべてのマウスが適切な麻酔を受けた後、テールピンチで麻酔を確認します。麻酔をかけたマウスを清潔で滅菌された面に置き、動物を切歯で吊るし、前肢をそっとテープで固定します(図1A)。注:動物の健康を確保するために、麻酔をかけたすべての動物に角膜潤滑を提供してください。カルボキシメチルセルロース点眼薬は、片眼につき1滴を塗布して使用することができる。 首の部分を剃り、クロルヘキシジンと70%アルコールでその部分を消毒します。手術用ハサミを使用して、気管を視覚化するために、1 cmの表在性正中線頸部切開を行います(図1B)。小さな切開は1回で十分ですが、脂肪組織が豊富に見られる場合は、脂肪組織を慎重に垂直に切開して気管を視覚化します。注:滅菌手袋と滅菌器具は、先端のみの手法で使用してください。手順が無菌条件下で行われる場合、感染のリスクは最小限に抑えられます。 鉗子を使用して、各マウスに挿管します。舌を静かに外側に引き、口から20Gの血管カテーテルを導入し、カテーテルを気管に進めます。挿管を容易にするために、気管に穏やかな圧力をかけます。注:気管はマウスの体の前方にあるため、カテーテルの先端を少し曲げると、マウスを正常に挿管するための角度を得るのに役立ちます。首の切開は、主に視覚化目的で行われます。あるいは、オペレーターは盲目的に気管を挿管することもできます。 挿管後、マウスを人工呼吸器に接続して挿管を確認します。この手順で使用される通常の人工呼吸器のパラメータは、200μLの脳卒中量と毎分200ストロークです。人工呼吸器の速度を短時間上下に回して、すばやく簡単に確認できます。 挿管を確認した後、マウスを呼吸器から切り離し、200μLのピペットゲルローディングチップを使用して、血管カテーテルを通して50μLの細菌剤を慎重に注入します。対照マウスの場合は、50 μL の滅菌 TH ブロスを注入します。 細菌剤を点眼した後、マウスを再び呼吸器に接続して、呼吸を再開させます。マウスを呼吸器に30〜60秒間置いておきます。すべてのマウスを注射した後、マウスの呼吸を監視します。呼吸が遅いパターンがある場合は、マウスを再び人工呼吸器に接続します。 皮膚に接着剤を1滴加えて、切開部を閉じます。皮膚のひだをまとめ、接着剤が乾くまで穏やかな圧力をかけます。 マウスを回復のために加熱パッドに置き、十分な意識を取り戻すまでマウスを注意深く監視します。完全に回復したら、マウスをケージに戻します。術後の痛み/苦痛管理のために、マウスはブプレノルフィンで、0.05-0.1mg / kgの用量で皮下(SC)で治療することができます。注:体重減少が20%を超える動物、または無気力、水や食物に到達できない、呼吸困難、外部刺激に対する反応障害、または精神的覚醒の低下など、処置後に重大な苦痛を経験している動物は安楽死させる必要があります。 5.気管支肺胞洗浄と肺の収穫 マウスを5%イソフルランが入った密閉容器に入れて安楽死させます。マウスの呼吸が止まった後、1分間イソフルラン曝露を続けます。.安楽死を確認するために開胸術を行います。注:目視検査と身体検査で安楽死を確認します。心臓の鼓動が止まり、マウスは息をしていないに違いありません。粘膜は白または淡いはずです。 マウスを清潔な手術用ボードの上に仰臥位に置き、切歯で吊るします。マウスの皮膚に70%エタノールをスプレーします。手術用ハサミを使用して、マウスの気管を視覚化するために、小さな表面的な正中線頸部切開を行います。 20Gのカテーテルで気管をカニューレ挿入します。慎重に、1 mLのシリンジを使用して、1 mLのカルシウムを含まないリン酸緩衝生理食塩水(PBS)を気管内に加えます。.肺を完全に拡張してから、同じシリンジを使用して液体を吸引します。この手順を合計2mL繰り返します。 BALを2mLアリコートに移します。このステップを2回行い、最終容量を2 mLにします。肺胞のスペースが混乱するリスクが高いため、一度に1mLを超えて肺を洗浄しないでください。. 胸腔を開き、ハサミと鉗子を使用して肺、心臓、気管を露出させます。横隔膜を慎重に解剖し、胸郭を取り外します。肺組織を挟まないように注意してください。 腹部の大動脈を横断して、放血を可能にします。はさみを使用して右心室に約2mmの小さな切開を行い、肺組織を灌流し、20Gのカテーテルを使用して5mLの冷たいPBSを注入します。PBSは肺を灌流する必要があります。適切な灌流が行われると、肺組織は白く青白くなり、PBSは腹部大動脈を通って血管内コンパートメントを離れます。 慎重に、肺を摘出し、気管からそれらを解剖して、組織学または単一細胞懸濁液へのさらなる処理を行います。 組織学のために処理する場合は、ホルマリン溶液(中性緩衝10%)で肺を25cmH2Oまで膨らませるために20Gカテーテルを慎重に挿入します。肺が通気されたら、気管の下に長さ約5cmの3.0縫合糸を通し、ホルマリンが肺組織に留まるように2回しっかりと結びます。肺を他の組織から静かに解剖し、10mLのホルマリン溶液が入った15mLの円錐形チューブに入れます。 6.気管支肺胞洗浄処理 BALを500 x g 、4°Cで5分間遠心分離します。無細胞上清を別のチューブで取り出し、-80°Cで保存します。注:BAL上清では、タンパク質の定量化(BCAアッセイ13など)や特定のバイオマーカーやサイトカインの測定(ELISAアッセイ、MSDやLuminexなどのプラットフォームを使用した複数のアッセイ)など、さらなる分析を行うことができます。 100 μLの溶解バッファーを1分間加えて、赤血球を溶解します。1 mLのPBSを加えて溶解反応を中和します。BALを500 x g 、4°Cで5分間遠心分離し、上清を除去します。 細胞をPBS(100-300 μL;細胞ペレットサイズに基づく)に再懸濁します。0.4% トリパンブルーステインによる細胞カウントを、手動または自動の細胞カウントにより行います。残りのペレットをフローサイトメトリー染色に使用したり、液体窒素中で凍結保存(凍結保存溶液に再懸濁)してさらに試験します。 7. 単一細胞懸濁液の肺プロセシング 肺を他の組織からそっと解剖し、5mLの冷たいPBSを含む15mLの円錐形チューブに入れます。PBSから肺を取り出し、ペーパータオルを使用して乾かします。 1 mgのDNaseと5 mgのコラゲナーゼを1 mLの低グルコースダルベッコ修飾イーグル培地(DMEM)に加えて、消化カクテルを準備します。.肺を1 mLの消化カクテルが入ったCチューブに移します。. Cチューブを組織解離器に移し、肺組織14を処理するための標準化されたプロトコルに従います。 冷たいPBS10mLをCチューブに加え、適切に混合します。50 mLコニカルチューブの上に70 μmセルストレーナーを使用して、シングルセル懸濁液をろ過します。ろ過を2回行います。 懸濁液を500 x g 、4°Cで5分間遠心分離します。上清を慎重にデカントし、1 mLの溶解バッファーを室温で1分間加えます。冷たいPBSを10mL加えて溶解反応を停止し、上清を取り除きます。 懸濁液を500 x g 、4°Cで5分間遠心分離します。上清を慎重にデカントし、冷たいPBS10mLを加えます。 トリパンブルーステインによる細胞カウントは、手動または自動の細胞カウントにより行います。フローサイトメトリー染色用の細胞ペレットを使用したり、液体窒素中で凍結保存してさらなる試験を行ったりします。