מודל ניסיוני להערכת רזולוציה של דלקת ריאות

כל הפרוטוקולים של בעלי חיים המתוארים במחקר זה אושרו על ידי הוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים (ACUC) באוניברסיטת ג’ונס הופקינס, בית הספר לרפואה עבור פרוטוקול בעלי חיים MO21M160. בנוסף, הניסויים בוצעו בהתאם לתקנות המוסדיות, המדינתיות והפדרליות למחקר בבעלי חיים. זהירות: השכפול של כל הפרוטוקולים המתוארים להלן דורש להתבצע בארון בטיחות ביולוגית רמה 2 (BSL-2), בהתאם לכל הנחיות BSL-2 המוסדיות תחת ארון הבטיחות הביולוגית. 1. ציפוי מלאי חיידקים מלולאות מסחריות הערה: פרוטוקול זה יכול לשמש לגידול מלאי חיידקים עבור Spn (ATCC 49619) ו – Kpn (ATCC 43816), החל מלולאות הכת המתקבלות מהספק (ראה טבלת חומרים לפרטים). חממו צלחת אגר 5% דם כבשים למשך 15 דקות בטמפרטורה של 37°C באינקובטור. אינקובטור תאים יכול לשמש למטרה זו. מתחת למכסה המנוע, מוציאים את הנדן מלולאת החיסון החיידקית ומפזרים אותו בזהירות, תוך כדי פסים לתוך צלחת האגר, לפי תבנית זיג-זג. חזור על שלב זה באמצעות לוח נפרד כעותק כפול. ניתן לפזר עד חמש צלחות באותה לולאה. יש לדגור על הצלחות למשך הלילה בטמפרטורה של 37°C לצמיחת חיידקים אופטימלית. מעבירים את החיידקים מדי יום במשך 3 ימים. מחממים את צלחות אגר הדם במשך 15 דקות ב 37 מעלות צלזיוס, לוקחים בין 15 ל -20 מושבות מצלחת האגר הראשונה באמצעות לולאת חיסון חד פעמית, ומפזרים אותם לצלחת אגר חדשה שחוממה מראש. תייגו את הצלחת בהתאם. 2. גידול חיידקים ואחסונם לשימוש עתידי לאחר 3 ימים, הרימו עד 30 מושבות מצלחת אגר הדם עם לולאת פסים, והניחו אותה ישירות לתוך בקבוק של 250 מ”ל המכיל מרק טוד יואיט (מרק TH). דוגרים ב-37°C, רועדים ב-250 סל”ד, עם 5%CO2 למשך כ-4 שעות. קח aliquots כל 15 דקות כדי למדוד את OD620nm עד שהוא מגיע 0.3, אשר שווה ערך כ 3 x 108 יחידות יצירת מושבה (CFU) לכל מ”ל. Aliquot החוצה 1 מ”ל של מלאי החיידקים החדשים מיד לתוך 2 מ”ל בקבוקונים קריוגניים. הקפיאו את הבקבוקונים הטריים בחנקן נוזלי למשך 5 דקות. לאחסן aliquots של חיידקים במקפיא -80 מעלות צלזיוס (בקבוקונים יכולים לשמש עד 6-8 חודשים לפני שהם מאבדים עוצמה). לאחר 7 ימים של הקפאה, aliquots ניתן להשתמש עבור מחקרים בבעלי חיים. לכן, לקבוע את הריכוז החדש של החיידקים. 3. הפשרת חיידקים לצורך החדרה תוך טרכאלית מחממים צלחת אגר דם במשך 10 דקות ב 37 ° C בשייקר. קחו את אחד מבקבוקוני המלאי החדשים מהמקפיא והפשירו אותו על ידי תסיסה עדינה באמבט מים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך כ-2 דקות. הימנעו מלגעת בטבעת ה-O או במכסה עם המים החמים. צלחת על צלחת אגר דם כדי לספור ידנית את מושבות החיידקים. בצע דילול 1 x 10-6 , צלחת 200 μL מן הדילול האחרון בצלחת אגר דם שחומם מראש. עשו זאת בכפילויות. לדגור על הצלחות במשך הלילה ב 37 ° C לצמיחה אופטימלית של החיידקים. למחרת, החל את הנוסחה הבאה כדי לקבוע את ריכוז החיידקים החדש: CFU/mL = (מספר מושבות x גורם דילול) / נפח מצופה מלאי 4. החדרה intratracheal של חיידקים חיים הערה: פרוטוקול זה עבר אופטימיזציה להחדרה של נפח של 50 μL תוך קנה הנשימה. ניתן לאחסן מלאי חיידקים עד 6-9 חודשים. כדי להבטיח את ה-CFU החיידקי בכל בקבוקון, הקפידו לצלוח אותו לפני כל ניסוי, לחשב את מלאי החיידקים CFU כמתואר לעיל, ולהשתמש בציר TH לדילולים הבאים. זהירות: מתחת לארון הבטיחות הביולוגית, בצע הליך הישרדות מכרסמים באמצעות כלי ניתוח סטריליים. להרדים את העכבר על ידי הזרקת intraperitoneally 100 מ”ג / ק”ג של קטמין ו 2.5 מ”ג / ק”ג של אצטילפרומזין. חזור על מספר העכברים המוזרקים בכל פעם.הערה: עכברים יכולים להיחשף לאיזופלורן כדי להקל על הטיפול בבעלי חיים. עם זאת, מטפל מנוסה המסוגל להזריק חומרי הרדמה תוך צפקיים מבלי לגרום למצוקה משמעותית של בעלי חיים יכול להימנע מחשיפה לאיזופלורן. מספר העכברים שיש להזריק תלוי במומחיות של המנתח. לאחר שכל העכברים נמצאים תחת הרדמה מתאימה, יש לאשר את ההרדמה על ידי צביטת זנב. הניחו את העכבר המרדים על משטח נקי ומעוקר, תלו את החיה ליד החותכות והדביקו בעדינות את הגפיים הקדמיות (איור 1A).הערה: כדי להבטיח את בריאות בעלי החיים, לספק סיכה הקרנית בכל בעלי החיים מורדמים. ניתן להשתמש בטיפות עיניים Carboxymethylcellulose, החלת טיפה אחת לכל עין. יש לגלח את אזור הצוואר ולחטא את האזור עם כלורהקסידין ו-70% אלכוהול. בעזרת מספריים כירורגיים, בצעו חתך שטחי של 1 ס”מ בצוואר בקו האמצע כדי להמחיש את קנה הנשימה (איור 1B). חתך קטן אחד אמור להספיק, אך אם רואים שפע של רקמת שומן, נתחו בזהירות את רקמת השומן אנכית כדי לדמיין את קנה הנשימה.הערה: השתמש בכפפות סטריליות ובמכשירים סטריליים באמצעות טכניקת הטיפים בלבד. הסיכון לזיהום הוא מינימלי אם ההליך מבוצע בתנאים סטריליים. באמצעות מלקחיים, intubate כל עכבר. משוך את הלשון החוצה בעדינות והכנס קטטר אנגיו 20 גרם דרך הפה, מקדם את הצנתר לתוך קנה הנשימה. הפעל לחץ עדין על קנה הנשימה כדי להקל על אינטובציה.הערה: מכיוון שקנה הנשימה הוא קדמי לגוף העכבר, כופף מעט את קצה הצנתר, מכיוון שזה יעזור לקבל את הזווית כדי לבצע אינטובציה מוצלחת לעכבר. החתך בצוואר מבוצע בעיקר למטרות הדמיה; לחילופין, המפעיל יכול לבצע אינטובציה עיוורת לקנה הנשימה. לאחר אינטובציה, חבר את העכבר למכונת הנשמה כדי לאשר אינטובציה. פרמטרי ההנשמה הרגילים המשמשים בהליך זה הם 200 מיקרוליטר של נפח שבץ ו -200 פעימות לדקה. הגבירו ו/או הנמיכו את קצב מכונות ההנשמה לזמן קצר לאישור מהיר וקל. לאחר אישור אינטובציה, נתק את העכבר ממכונת ההנשמה והחדיר בזהירות 50 μL של סוכן החיידקים דרך קטטר אנגיו באמצעות קצה העמסת ג’ל פיפט 200 μL. עבור עכברי ביקורת, להזריק 50 μL של מרק TH סטרילי. לאחר החדרת החומר החיידקי, חבר שוב את העכבר למכונת ההנשמה כדי לסייע בחידוש הנשימה. השאירו את העכבר על מכונת ההנשמה למשך 30-60 שניות. לאחר הזרקת כל העכברים, לפקח על הנשימה שלהם. אם יש דפוס נשימה איטי, חברו שוב את העכברים למכונת הנשמה. סגור את החתך על ידי הוספת טיפה אחת קטנה של דבק על העור. חברו יחד את קפלי העור והפעילו לחץ עדין עד שהדבק מתייבש. הניחו את העכברים על כרית חימום להתאוששות ועקבו אחריהם מקרוב עד שיחזרו להכרה מספקת. העבירו את העכברים בחזרה לכלוב לאחר שהחלימו לחלוטין. לטיפול בכאב/מצוקה לאחר הניתוח, ניתן לטפל בעכברים באמצעות בופרנורפין, במינון של 0.05-0.1 מ”ג/ק”ג תת עורית (SC).הערה: בעלי חיים עם ירידה במשקל של יותר מ -20% או חווים מצוקה משמעותית לאחר ההליך כגון עייפות, חוסר יכולת להגיע למים או מזון, נשימה מאומצת, תגובה לקויה לגירויים חיצוניים, או ירידה בערנות מנטלית יש להרדים. 5. שטיפת סימפונות וקציר ריאות הרדימו את העכבר על ידי הצבתו במיכל סגור המכיל 5% איזופלורן. המשך חשיפה לאיזופלורן למשך דקה אחת לאחר שהעכבר מפסיק לנשום. בצע thoracotomy כדי לאשר המתת חסד.הערה: יש לאשר המתת חסד באמצעות בדיקה חזותית וגופנית. הלב כנראה הפסיק לפעום והעכברים לא נשמו. ריריות צריכות להיות לבנות או חיוורות. הניחו את העכבר במצב שכיבה על לוח ניתוחים נקי ותלו אותו ליד החותכות. רססו את עור העכבר באתנול 70%. באמצעות מספריים כירורגיים, לעשות חתך צוואר קטן שטחי קו האמצע כדי לדמיין את קנה הנשימה של העכבר. לערבב את קנה הנשימה עם קטטר 20 גרם. בזהירות, הוסף 1 מ”ל של מלח חוצץ פוספט ללא סידן (PBS) intratracheally, באמצעות מזרק 1 מ”ל. אפשר הרחבת ריאות מלאה, ולאחר מכן לשאוף את הנוזל באמצעות אותו מזרק. חזור על שלב זה עבור סך של 2 מ”ל. העבר את BAL לתוך aliquot 2 מ”ל. בצע שלב זה פעמיים עבור נפח סופי של 2 מ”ל. אין לשטוף את הריאות עם יותר מ 1 מ”ל בכל פעם, בשל הסיכון הגבוה של הפרעה בחלל alveolar. פתחו את חלל בית החזה וחשפו את הריאה, הלב וקנה הנשימה באמצעות מספריים ומלקחיים. בזהירות לנתח את הסרעפת ולהסיר את כלוב הצלעות. הקפידו לא לצבוט את רקמת הריאה. לחצות את אבי העורקים הבטני כדי לאפשר exsanguination. יש לנקב את רקמת הריאה על ידי ביצוע חתך קטן של כ-2 מ”מ בחדר ימין באמצעות מספריים ולהזריק 5 מ”ל PBS קר באמצעות קטטר 20 גרם. PBS צריך לחורר את הריאה. אם מבוצע זילוח מתאים, רקמת הריאה תהפוך לבנה חיוורת וה- PBS יעזוב את התא התוך כלי דרך אבי העורקים הבטן. בזהירות, לחלץ את הריאות ולנתח אותם מן קנה הנשימה לבצע או היסטולוגיה או עיבוד נוסף השעיה תא בודד. אם עיבוד עבור היסטולוגיה, בזהירות להכניס קטטר 20 G כדי לנפח את הריאות עד 25 ס”מ H2O עם תמיסת פורמלין (ניטרלי חוצץ 10%). לאחר שהריאות אינן מנופחות, העבירו חוט תפר 3.0 באורך של כ-5 ס”מ מתחת לקנה הנשימה, וקשרו אותו בחוזקה פעמיים כדי להבטיח שהפורמלין יישאר ברקמת הריאה. בעדינות, לנתח את הריאה משאר הרקמות ומניחים אותו בתוך צינור חרוטי 15 מ”ל המכיל 10 מ”ל של תמיסת פורמלין. 6. עיבוד שטיפה ברונכואלבאולרי צנטריפוגה את BAL ב 500 x גרם ב 4 ° C במשך 5 דקות. הסר את supernatant ללא תאים בצינור נפרד ואחסן ב -80 ° C.הערה: ניתן לבצע ניתוח נוסף בסופרנטנט BAL, כולל כימות חלבונים (למשל, בדיקת BCA13) או מדידה של סמנים ביולוגיים או ציטוקינים ספציפיים (מבחני ELISA ומבדקים מרובים עם פלטפורמות כגון MSD ולומינקס). Lyse את תאי הדם האדומים על ידי הוספת 100 μL של חיץ lysing במשך 1 דקות. נטרל את תגובת השקר על ידי הוספת 1 מ”ל של PBS. צנטריפוגו את ה-BAL בטמפרטורה של 500 x גרם ב-4°C למשך 5 דקות והסירו את הסופרנטנט. השהה מחדש את התאים ב- PBS (100-300 μL; בהתבסס על גודל כדורי התא). בצע ספירת תאים עם 0.4% כתם כחול טריפאן על ידי ספירת תאים ידנית או אוטומטית. השתמש בכדורית הנותרת לצביעת ציטומטריית זרימה ו / או שימור בהקפאה (על ידי השעיה בתמיסת שימור קריו) בחנקן נוזלי לבדיקות נוספות. 7. עיבוד ריאות להשעיית תא בודד נתחו בעדינות את הריאה משאר הרקמות והניחו אותה בצינור חרוטי של 15 מ”ל המכיל 5 מ”ל PBS קר. הסר את הריאה מ PBS ולייבש אותו באמצעות מגבת נייר. הכינו קוקטייל לעיכול על ידי הוספת 1 מ”ג DNase ו-5 מ”ג קולגנאז ל-1 מ”ל של מדיום נשר (DMEM) דל גלוקוז של Dulbecco. מעבירים את הריאה לצינור C המכיל 1 מ”ל קוקטייל עיכול. העבר את צינור C למפזר הרקמה ופעל לפי הפרוטוקול הסטנדרטי לעיבוד רקמת ריאה14. הוסף 10 מ”ל של PBS קר לתוך צינור C וערבב כראוי. סנן את מתלה התא הבודד באמצעות מסננת תאים של 70 מיקרומטר על גבי צינור חרוטי של 50 מ”ל. בצעו את הסינון פעמיים. צנטריפוגה את המתלה ב 500 x גרם ב 4 ° C במשך 5 דקות. מרוקנים בזהירות את הסופרנאטנט ומוסיפים 1 מ”ל של חיץ שכיבה למשך דקה אחת בטמפרטורת החדר. הוסף 10 מ”ל של PBS קר כדי לעצור את תגובת השקר ולהסיר supernatant. צנטריפוגה את המתלה ב 500 x גרם ב 4 ° C במשך 5 דקות. בזהירות decant supernatant ולהוסיף 10 מ”ל של PBS קר. בצע ספירת תאים עם כתם כחול טריפאן על ידי ספירת תאים ידנית או אוטומטית. השתמש בכדורית תא לצביעת ציטומטריית זרימה ו / או שימור בהקפאה בחנקן נוזלי לבדיקות נוספות.