Modelo experimental para evaluar la resolución de la neumonía

Todos los protocolos animales descritos en este estudio fueron aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales (ACUC) de la Facultad de Medicina de la Universidad Johns Hopkins para el MO21M160 de protocolo animal. Además, los experimentos se realizaron siguiendo las regulaciones institucionales, estatales y federales para la investigación con animales. PRECAUCIÓN: La replicación de todos los protocolos descritos a continuación requiere que se realice en un gabinete de nivel de bioseguridad 2 (BSL-2), siguiendo todas las pautas institucionales de BSL-2 bajo el gabinete de bioseguridad. 1. Recubrimiento de existencias bacterianas de bucles comerciales NOTA: Este protocolo se puede utilizar para aumentar las reservas bacterianas para Spn (ATCC 49619) y Kpn (ATCC 43816), comenzando con los culti-loops obtenidos del proveedor (consulte la Tabla de materiales para obtener más detalles). Calentar una placa de agar sangre de oveja al 5% durante 15 min a 37 °C en una incubadora. Para ello se puede utilizar una incubadora de células. Debajo del capó, retire la funda del circuito de inoculación bacteriana y extiéndala con cuidado, rayando en la placa de agar, siguiendo un patrón en zig-zag. Repita este paso usando un plato separado como duplicado. Se pueden rayar hasta cinco placas con el mismo bucle. Incubar las placas durante la noche a 37 °C para un crecimiento óptimo de las bacterias. Deje pasar las bacterias diariamente durante 3 días. Calentar las placas de agar sangre durante 15 min a 37 °C, tomar entre 15 y 20 colonias de la primera placa de agar utilizando un asa de inoculación desechable y extenderlas en una nueva placa de agar precalentada. Etiquete el plato de manera adecuada. 2. Crecimiento y almacenamiento de bacterias para uso futuro Después de 3 días, recoja hasta 30 colonias de la placa de agar sangre con un bucle de rayas y colóquelas directamente en un matraz de 250 ml que contenga caldo Todd Hewitt (caldo TH). Incubar a 37 °C, agitando a 250 rpm, con 5% de CO2 durante aproximadamente 4 h. Tome alícuotas cada 15 minutos para medir el diámetro exterior de620 nm hasta que alcance 0,3, lo que equivale a aproximadamente 3 x 108 unidades formadoras de colonias (UFC) por ml. Retire 1 mL del nuevo stock de bacterias inmediatamente en viales criogénicos de 2 mL. Congele rápidamente los viales recién alículos en nitrógeno líquido durante 5 min. Almacene las alícuotas de bacterias en un congelador a -80 °C (los viales se pueden utilizar hasta 6-8 meses antes de que pierdan potencia). Después de 7 días de congelación, las alícuotas se pueden utilizar para estudios en animales. Por lo tanto, determine la nueva concentración de las bacterias. 3. Descongelación de bacterias para la instilación intratraqueal Calentar una placa de agar sangre durante 10 minutos a 37 °C en una coctelera. Tome uno de los nuevos viales de reserva del congelador y descongélelo agitándolo suavemente en un baño de agua a 37 °C durante aproximadamente 2 minutos. Evite tocar la junta tórica o la tapa con agua tibia. Placa en una placa de agar sangre para contar manualmente las colonias bacterianas. Realice una dilución de 1 x 10-6 y coloque 200 μL de la última dilución en una placa de agar sangre precalentada. Hazlo por duplicado. Incubar las placas durante la noche a 37 °C para un crecimiento óptimo de las bacterias. Al día siguiente, aplicar la siguiente fórmula para determinar la nueva concentración bacteriana: UFC/mL = (número de colonias x factor de dilución) / volumen de caldo sembrado 4. Instilación intratraqueal de bacterias vivas NOTA: Este protocolo ha sido optimizado para instilar un volumen de 50 μL por vía intratraqueal. Las existencias bacterianas se pueden almacenar hasta 6-9 meses. Para asegurar la presencia de UFC bacterianas en cada vial, asegúrese de colocarlo en una placa antes de cada experimento, calcule la UFC de reserva bacteriana como se describió anteriormente y use caldo TH para diluciones posteriores. PRECAUCIÓN: Debajo del gabinete de bioseguridad, realice un procedimiento de supervivencia de roedores utilizando instrumentos quirúrgicos estériles. Anestesiar al ratón inyectando por vía intraperitoneal 100 mg/kg de ketamina y 2,5 mg/kg de acetilpromazina. Repita el procedimiento para el número de ratones que se inyectan a la vez.NOTA: Los ratones pueden estar expuestos al isoflurano para facilitar el manejo de los animales. Sin embargo, un manipulador experimentado que sea capaz de inyectar anestésicos intraperitoneales sin causar un sufrimiento significativo en los animales puede evitar la exposición al isoflurano. El número de ratones a inyectar depende de la experiencia del cirujano. Después de que todos los ratones estén bajo la anestesia adecuada, confirme la anestesia con un pellizco de cola. Coloque el ratón anestesiado sobre una superficie limpia y esterilizada, cuelgue al animal por los incisivos y pegue suavemente las extremidades anteriores con cinta adhesiva (Figura 1A).NOTA: Para garantizar el bienestar animal, proporcionar lubricación corneal en todos los animales anestesiados. Se pueden utilizar colirios de carboximetilcelulosa, aplicando una gota por ojo. Afeitar la región del cuello y desinfectar la zona con clorhexidina y alcohol al 70%. Con unas tijeras quirúrgicas, realice una incisión superficial de 1 cm en la línea media del cuello para visualizar la tráquea (Figura 1B). Una pequeña incisión debería ser suficiente, pero si se observa una abundancia de tejido graso, diseccione cuidadosamente el tejido adiposo verticalmente para visualizar la tráquea.NOTA: Utilice guantes estériles e instrumentos estériles mediante la técnica de solo puntas. El riesgo de infección es mínimo si el procedimiento se realiza en condiciones estériles. Con fórceps, intuble cada ratón. Tire suavemente de la lengua hacia afuera e introduzca un angiocatéter de 20 G a través de la boca, avanzando el catéter hacia la tráquea. Aplique una presión suave sobre la tráquea para facilitar la intubación.NOTA: Debido a que la tráquea es anterior al cuerpo del ratón, doble ligeramente la punta del catéter, ya que esto ayudará a obtener el ángulo para intubar con éxito al ratón. La incisión en el cuello se realiza principalmente con fines de visualización; Alternativamente, el operador puede intubar la tráquea a ciegas. Después de la intubación, conecte el ratón a un respirador para confirmar la intubación. Los parámetros regulares del ventilador utilizados en este procedimiento son 200 μL de volumen sistólico y 200 brazadas por minuto. Suba y/o baje brevemente la tasa del ventilador para una confirmación rápida y sencilla. Después de confirmar la intubación, desconecte el ratón del respirador y instile cuidadosamente 50 μL del agente bacteriano a través del angiocatéter con una punta de carga de gel de pipeta de 200 μL. Para ratones control, inyectar 50 μL de caldo TH estéril. Después de instilar el agente bacteriano, vuelva a conectar el ratón al respirador para ayudar a reiniciar la respiración. Deje el ratón en el respirador durante 30-60 s. Después de inyectar a todos los ratones, controle su respiración. Si hay un patrón de respiración lento, vuelva a conectar los ratones al respirador. Cierre la incisión agregando una pequeña gota de pegamento sobre la piel. Junta los pliegues de la piel y aplica una presión suave hasta que el pegamento se seque. Coloque a los ratones en una almohadilla térmica para su recuperación y vigílelos de cerca hasta que recuperen la conciencia suficiente. Transfiera a los ratones de regreso a la jaula una vez que estén completamente recuperados. Para el tratamiento del dolor/sufrimiento postoperatorio, los ratones pueden ser tratados con buprenorfina, con una dosis de 0,05-0,1 mg/kg por vía subcutánea (SC).NOTA: Los animales con una pérdida de peso superior al 20% o que experimentan una angustia significativa después del procedimiento, como letargo, incapacidad para alcanzar agua o comida, dificultad para respirar, deterioro de la respuesta a estímulos externos o disminución del estado de alerta mental, deben ser sacrificados. 5. Lavado broncoalveolar y extracción pulmonar Aplicar la eutanasia al ratón colocándolo en un recipiente cerrado que contenga un 5% de isoflurano. Continúe la exposición al isoflurano durante 1 minuto después de que el ratón deje de respirar. Realizar una toracotomía para confirmar la eutanasia.NOTA: Confirmar la eutanasia mediante un examen visual y físico. El corazón debe haber dejado de latir y los ratones no respirar. Las membranas mucosas deben ser blancas o pálidas. Coloque el ratón en posición supina sobre una tabla quirúrgica limpia y cuélguelo por los incisivos. Rocíe la piel del ratón con etanol al 70%. Con unas tijeras quirúrgicas, haga una pequeña incisión superficial en la línea media del cuello para visualizar la tráquea del ratón. Cánula de la tráquea con un catéter de 20 G. Con cuidado, agregue 1 mL de solución salina tamponada con fosfato (PBS) libre de calcio por vía intratraqueal, usando una jeringa de 1 mL. Permita la expansión completa del pulmón y luego aspire el líquido con la misma jeringa. Repita este paso hasta un total de 2 ml. Transfiera el BAL a una alícuota de 2 mL. Realice este paso dos veces para obtener un volumen final de 2 ml. No lave los pulmones con más de 1 ml a la vez, debido al alto riesgo de alteración del espacio alveolar. Abra la cavidad torácica y exponga el pulmón, el corazón y la tráquea con tijeras y fórceps. Diseccione cuidadosamente el diafragma y retire la caja torácica. Asegúrese de no pellizcar el tejido pulmonar. Transectar la aorta abdominal para permitir la exanguinación. Perfundir el tejido pulmonar haciendo una pequeña incisión de aproximadamente 2 mm en el ventrículo derecho con unas tijeras e inyectar 5 mL de PBS frío con un catéter de 20 G. El PBS debe perfundir el pulmón. Si se realiza una perfusión adecuada, el tejido pulmonar se volverá blanco pálido y el PBS saldrá del compartimento intravascular a través de la aorta abdominal. Con cuidado, extraiga los pulmones y diseccionelos de la tráquea para realizar la histología o el procesamiento posterior a una suspensión unicelular. Si se procesa para histología, inserte cuidadosamente un catéter de 20 G para inflar los pulmones hasta 25 cm H2O con solución de formol (10% tamponado neutro). Una vez que los pulmones estén insuflados, pase una cuerda de sutura 3.0 de unos 5 cm de largo por debajo de la tráquea y átela firmemente dos veces para asegurarse de que la formalina permanezca en el tejido pulmonar. Diseccione suavemente el pulmón del resto de los tejidos y colóquelo en un tubo cónico de 15 ml que contenga 10 ml de solución de formalina. 6. Procesamiento de lavado broncoalveolar Centrifugar el BAL a 500 x g a 4 °C durante 5 min. Retire el sobrenadante libre de células en un tubo separado y guárdelo a -80 °C.NOTA: Se pueden realizar análisis adicionales en el sobrenadante BAL, incluida la cuantificación de proteínas (por ejemplo, ensayo BCA13) o la medición de biomarcadores específicos o citocinas (ensayos ELISA y ensayos múltiples con plataformas como MSD y Luminex). Lisar los glóbulos rojos añadiendo 100 μL de tampón lisante durante 1 min. Neutralizar la reacción de lisis añadiendo 1 mL de PBS. Centrifugar el BAL a 500 x g a 4 °C durante 5 min y retirar el sobrenadante. Vuelva a suspender las células en PBS (100-300 μL; según el tamaño de los gránulos de las células). Realice un recuento de células con tinción de azul de tripano al 0,4% mediante recuento de células manual o automatizado. Utilice el gránulo restante para la tinción por citometría de flujo y/o la criopreservación (mediante la resuspensión en una solución criopreservante) en nitrógeno líquido para realizar más pruebas. 7. Procesamiento pulmonar para suspensión unicelular Diseccione suavemente el pulmón del resto de los tejidos y colóquelo en un tubo cónico de 15 mL que contenga 5 mL de PBS frío. Retire el pulmón del PBS y séquelo con una toalla de papel. Prepare un cóctel de digestión añadiendo 1 mg de DNasa y 5 mg de colagenasa en 1 mL de medio de águila modificado de Dulbecco (DMEM) bajo en glucosa. Transfiera el pulmón a un tubo C que contiene 1 mL de cóctel de digestión. Transfiera la sonda C al disociador tisular y siga el protocolo estandarizado para el procesamiento del tejido pulmonar14. Agregue 10 ml de PBS frío en el tubo C y mezcle correctamente. Filtre la suspensión de una sola célula utilizando un filtro de células de 70 μm sobre un tubo cónico de 50 mL. Realice la filtración dos veces. Centrifugar la suspensión a 500 x g a 4 °C durante 5 min. Decantar cuidadosamente el sobrenadante y añadir 1 mL de tampón lisante durante 1 min a temperatura ambiente. Agregue 10 mL de PBS frío para detener la reacción de lisis y eliminar el sobrenadante. Centrifugar la suspensión a 500 x g a 4 °C durante 5 min. Decantar cuidadosamente el sobrenadante y añadir 10 mL de PBS frío. Realice un recuento de células con tinción de azul de tripán mediante recuento de células manual o automatizado. Utilice un pellet de célula para la tinción por citometría de flujo y/o criopreservación en nitrógeno líquido para realizar pruebas adicionales.