Pnömoni Çözünürlüğünü Değerlendirmek için Deneysel Model

Bu çalışmada açıklanan tüm hayvan protokolleri, hayvan protokolü MO21M160 için Johns Hopkins Üniversitesi Tıp Fakültesi’ndeki Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi (ACUC) tarafından onaylanmıştır. Ek olarak, deneyler hayvan araştırmaları için kurumsal, eyalet ve federal düzenlemelere uygun olarak gerçekleştirildi. DİKKAT: Aşağıda açıklanan tüm protokollerin çoğaltılmasının, biyogüvenlik kabini altındaki tüm kurumsal BSL-2 yönergelerine uygun olarak bir Biyogüvenlik seviye 2 (BSL-2) kabininde gerçekleştirilmesi gerekir. 1. Bakteri stoklarının ticari döngülerden kaplanması NOT: Bu protokol, sağlayıcıdan elde edilen çeşit ilmeklerden başlayarak Spn (ATCC 49619) ve Kpn (ATCC 43816) için bakteri stoklarının yetiştirilmesi için kullanılabilir (ayrıntılar için Malzeme Tablosuna bakın). %5’lik bir koyun kanı agar plakasını bir kuluçka makinesinde 37 °C’de 15 dakika ısıtın. Bu amaçla bir hücre inkübatörü kullanılabilir. Kaputun altında, kılıfı bakteri aşılama halkasından çıkarın ve zikzak bir desen izleyerek agar plakasına çizerek dikkatlice yayın. Kopya olarak ayrı bir plaka kullanarak bu adımı tekrarlayın. Aynı döngü ile en fazla beş plaka çizilebilir. Optimum bakteri üremesi için plakaları gece boyunca 37 °C’de inkübe edin. Bakterileri 3 gün boyunca günlük olarak geçirin. Kanlı agar plakalarını 37 ° C’de 15 dakika ısıtın, tek kullanımlık bir aşılama halkası kullanarak ilk agar plakasından 15 ila 20 koloni alın ve bunları yeni, önceden ısıtılmış bir agar plakasına yayın. Plakayı uygun şekilde etiketleyin. 2. Gelecekte kullanılmak üzere bakteri üremesi ve depolanması 3 gün sonra, bir çizgi halkası ile kanlı agar plakasından 30’a kadar koloni alın ve doğrudan Todd Hewitt suyu (TH suyu) içeren 250 mL’lik bir şişeye yerleştirin. 37 ° C’de, 250 rpm’de çalkalayarak, yaklaşık 4 saat% 5 CO2 ile inkübe edin. OD620nm’yi 0.3’e ulaşana kadar ölçmek için her 15 dakikada bir alikot alın, bu da mL başına yaklaşık 3 x 108 koloni oluşturan birime (CFU) eşdeğerdir. Yeni bakteri stoğunun 1 mL’sini hemen 2 mL’lik kriyojenik şişelere boşaltın. Taze aliquoted şişeleri 5 dakika boyunca sıvı nitrojen içinde dondurun. Bakteri parçalarını -80 ° C’lik bir dondurucuda saklayın (şişeler, güçlerini kaybetmeden önce 6-8 aya kadar kullanılabilir). 7 günlük donmadan sonra, alikotlar hayvan çalışmaları için kullanılabilir. Bu nedenle, bakterilerin yeni konsantrasyonunu belirleyin. 3. İntratrakeal damlatma için bakteri çözme Bir kanlı agar plakasını bir çalkalayıcıda 37 °C’de 10 dakika ısıtın. Dondurucudan yeni stok şişelerinden birini alın ve 37 ° C’lik bir su banyosunda yaklaşık 2 dakika boyunca hafifçe çalkalayarak çözdürün. O-ringe veya kapağa ılık suyla dokunmaktan kaçının. Bakteri kolonilerini manuel olarak saymak için bir kan agar plakası üzerindeki plaka. 1 x 10-6 seyreltme gerçekleştirin ve önceden ısıtılmış bir kan agar plakasında son seyreltmeden 200 μL plaka yapın. Bunu iki kopya halinde yapın. Bakterilerin en iyi şekilde büyümesi için plakaları gece boyunca 37 °C’de inkübe edin. Ertesi gün, yeni bakteri konsantrasyonunu belirlemek için aşağıdaki formülü uygulayın: CFU/mL = (koloni sayısı x seyreltme faktörü) / kaplanmış stok hacmi 4. Canlı bakterilerin intratrakeal damlatılması NOT: Bu protokol, intratrakeal olarak 50 μL’lik bir hacim aşılamak için optimize edilmiştir. Bakteri stokları 6-9 aya kadar saklanabilir. Her şişede bakteriyel CFU’yu sağlamak için, her deneyden önce plakaladığınızdan emin olun, bakteri stok CFU’sunu yukarıda açıklandığı gibi hesaplayın ve sonraki seyreltmeler için TH suyu kullanın. DİKKAT: Biyogüvenlik kabininin altında, steril cerrahi aletler kullanarak bir kemirgen hayatta kalma prosedürü gerçekleştirin. İntraperitoneal olarak 100 mg / kg ketamin ve 2.5 mg / kg asetilpromazin enjekte ederek fareyi uyuşturun. Bir seferde enjekte edilen fare sayısı için tekrarlayın.NOT: Fareler, hayvan kullanımını kolaylaştırmak için izoflurana maruz kalabilir. Bununla birlikte, önemli hayvan sıkıntısına neden olmadan intraperitoneal anestezikleri enjekte edebilen deneyimli bir işleyici, izofluran maruziyetini önleyebilir. Enjekte edilecek fare sayısı cerrahın uzmanlığına bağlıdır. Tüm fareler uygun anestezi altında olduktan sonra, anesteziyi kuyruk tutamıyla onaylayın. Anestezi uygulanmış fareyi temiz ve sterilize edilmiş bir yüzeye yerleştirin, hayvanı kesici dişlerinden asın ve ön ayakları nazikçe bantlayın (Şekil 1A).NOT: Hayvan sağlığını sağlamak için, anestezi uygulanan tüm hayvanlarda kornea kayganlığı sağlayın. Karboksimetilselüloz göz damlası kullanılabilir, göz başına bir damla uygulanır. Boyun bölgesini tıraş edin ve bölgeyi klorheksidin ve% 70 alkol ile dezenfekte edin. Cerrahi makas kullanarak, trakeayı görüntülemek için 1 cm’lik yüzeyel orta hat boyun kesisi yapın (Şekil 1B). Küçük bir kesi yeterli olmalıdır, ancak bol miktarda yağ dokusu görülürse, trakeayı görselleştirmek için yağ dokusunu dikey olarak dikkatlice inceleyin.NOT: Yalnızca uç tekniği ile steril eldivenler ve steril aletler kullanın. İşlem steril koşullar altında yapılırsa enfeksiyon riski minimumdur. Forseps kullanarak, her fareyi entübe edin. Dili nazikçe dışarı doğru çekin ve kateteri trakeaya doğru ilerleterek ağızdan 20 G’lik bir anjiyo-kateter sokun. Entübasyonu kolaylaştırmak için trakea üzerine hafif bir baskı uygulayın.NOT: Trakea fare gövdesinin önünde olduğundan, kateterin ucunu hafifçe bükün, çünkü bu, fareyi başarılı bir şekilde entübe etmek için açıyı elde etmeye yardımcı olacaktır. Boyun kesisi esas olarak görselleştirme amaçlı yapılır; Alternatif olarak, operatör trakeayı kör olarak entübe edebilir. Entübasyondan sonra, entübasyonu onaylamak için fareyi bir solunum cihazına bağlayın. Bu prosedürde kullanılan normal ventilatör parametreleri 200 μL strok hacmi ve dakikada 200 stroktur. Hızlı ve kolay onay için ventilatör oranını kısa bir süre yukarı ve/veya aşağı çevirin. Entübasyonu onayladıktan sonra, fareyi solunum cihazından ayırın ve 200 μL’lik bir pipet jel yükleme ucu kullanarak anjiyo-kateter yoluyla 50 μL bakteri ajanını dikkatlice damlatın. Kontrol fareleri için 50 μL steril TH suyu enjekte edin. Bakteriyel ajanı damlattıktan sonra, solunumu yeniden başlatmaya yardımcı olmak için fareyi tekrar solunum cihazına bağlayın. Fareyi 30-60 saniye solunum cihazında bırakın. Tüm fareleri enjekte ettikten sonra solunumlarını izleyin. Yavaş bir solunum paterni varsa, fareleri tekrar solunum cihazına bağlayın. Cilde küçük bir damla yapıştırıcı ekleyerek kesiği kapatın. Cilt kıvrımlarını bir araya getirin ve tutkal kuruyana kadar hafif bir baskı uygulayın. Fareleri iyileşmek için bir ısıtma yastığına yerleştirin ve yeterli bilinçlerini geri kazanana kadar yakından izleyin. Tamamen iyileştikten sonra fareleri kafese geri aktarın. Ameliyat sonrası ağrı / sıkıntı yönetimi için, fareler deri altından (SC) 0.05-0.1 mg / kg’lık bir dozla buprenorfin ile tedavi edilebilir.NOT: ‘den fazla kilo kaybı olan veya işlem sonrası uyuşukluk, suya veya yiyeceğe ulaşamama, nefes almada zorluk, dış uyaranlara tepkide bozulma veya zihinsel uyanıklıkta azalma gibi önemli sıkıntılar yaşayan hayvanlara ötenazi yapılmalıdır. 5. Bronkoalveoler lavaj ve akciğer hasadı Fareyi% 5 izofluran içeren kapalı bir kaba koyarak ötenazi yapın. Fare nefes almayı bıraktıktan sonra 1 dakika boyunca izofluran maruziyetine devam edin. Ötenaziyi doğrulamak için torakotomi yapın.NOT: Görsel ve fizik muayene ile ötenaziyi onaylayın. Kalp atmayı bırakmış ve fareler nefes almıyor olmalı. Mukoza zarları beyaz veya soluk olmalıdır. Fareyi temiz bir cerrahi tahta üzerine sırtüstü pozisyonda yatırın ve kesici dişlerden asın. Fare derisine% 70 etanol püskürtün. Cerrahi makas kullanarak, farenin trakeasını görselleştirmek için küçük bir yüzeysel orta hat boyun kesisi yapın. Trakeayı 20 G’lik bir kateter ile kanüle edin. Dikkatlice, 1 mL’lik bir şırınga kullanarak intratrakeal olarak 1 mL kalsiyum içermeyen fosfat tamponlu salin (PBS) ekleyin. Tam akciğer genişlemesine izin verin ve ardından aynı şırıngayı kullanarak sıvıyı aspire edin. Bu adımı toplam 2 mL boyunca tekrarlayın. BAL’ı 2 mL’lik bir alikot içine aktarın. 2 mL’lik son hacim için bu adımı iki kez gerçekleştirin. Alveolar boşluğun bozulma riski yüksek olduğu için akciğerleri bir seferde 1 mL’den fazla lavaj yapmayın. Göğüs boşluğunu açın ve makas ve forseps kullanarak akciğeri, kalbi ve trakeayı ortaya çıkarın. Diyaframı dikkatlice inceleyin ve göğüs kafesini çıkarın. Akciğer dokusunu sıkıştırmadığınızdan emin olun. Kan kaybına izin vermek için abdominal aortu transekt edin. Makas kullanarak sağ ventrikülde yaklaşık 2 mm’lik küçük bir kesi yaparak akciğer dokusunu perfüze edin ve 20 G kateter kullanarak 5 mL soğuk PBS enjekte edin. PBS akciğere perfüze etmelidir. Yeterli bir perfüzyon yapılırsa, akciğer dokusu beyaza dönecek ve PBS abdominal aort yoluyla intravasküler bölmeyi terk edecektir. Dikkatlice, akciğerleri çıkarın ve histoloji veya tek hücreli süspansiyona daha fazla işlem yapmak için trakeadan inceleyin. Histoloji için işleniyorsa, akciğerleri formalin çözeltisi (nötr tamponlu% 10) ile 25 cm H2O’ya kadar şişirmek için dikkatlice 20 G’lik bir kateter yerleştirin. Akciğerler insüflasyona uğradıktan sonra, trakeanın altından yaklaşık 5 cm uzunluğunda bir 3.0 dikiş ipi geçirin ve formalinin akciğer dokusunda kalmasını sağlamak için iki kez sıkıca bağlayın. Nazikçe, akciğeri dokuların geri kalanından ayırın ve 10 mL formalin çözeltisi içeren 15 mL’lik konik bir tüpe yerleştirin. 6. Bronkoalveoler lavaj işleme BAL’ı 500 x g’da 4 °C’de 5 dakika santrifüjleyin. Hücresiz süpernatanı ayrı bir tüpte çıkarın ve -80 °C’de saklayın.NOT: BAL süpernatında, protein miktar tayini (örneğin, BCA testi13) veya spesifik biyobelirteçlerin veya sitokinlerin ölçümü (ELISA testleri ve MSD ve Luminex gibi platformlarla çoklu tahliller) dahil olmak üzere daha fazla analiz yapılabilir. 1 dakika boyunca 100 μL parçalama tamponu ekleyerek kırmızı kan hücrelerini parçalayın. 1 mL PBS ekleyerek parçalanma reaksiyonunu nötralize edin. BAL’ı 5 dakika boyunca 4 ° C’de 500 x g’da santrifüjleyin ve süpernatanı çıkarın. Hücreleri PBS’de yeniden süspanse edin (100-300 μL; hücre pelet boyutuna bağlı olarak). Manuel veya otomatik hücre sayımı ile %0,4 tripan mavisi lekesi olan bir hücre sayımı gerçekleştirin. Daha fazla test için sıvı nitrojen içinde akış sitometrisi boyama ve/veya kriyoprezervasyon (kriyoprezervasyon solüsyonunda yeniden süspanse ederek) için kalan peleti kullanın. 7. Tek hücreli süspansiyon için akciğer işleme Akciğeri dokuların geri kalanından nazikçe inceleyin ve 5 mL soğuk PBS içeren 15 mL’lik konik bir tüpe yerleştirin. Akciğeri PBS’den çıkarın ve bir kağıt havlu kullanarak kurulayın. 1 mL düşük glikozlu Dulbecco’nun modifiye edilmiş Eagle’s besiyerine (DMEM) 1 mg DNaz ve 5 mg kollajenaz ekleyerek bir sindirim kokteyli hazırlayın. Akciğeri 1 mL sindirim kokteyli içeren bir C-tüpüne aktarın. C-tüpünü doku ayrıştırıcıya aktarın ve akciğer dokusunu işlemek için standartlaştırılmış protokolü izleyin14. C-tüpüne 10 mL soğuk PBS ekleyin ve uygun şekilde karıştırın. 50 mL’lik bir konik tüpün üstünde 70 μm’lik bir hücre süzgeci kullanarak tek hücreli süspansiyonu filtreleyin. Filtrelemeyi iki kez gerçekleştirin. Süspansiyonu 500 x g’de 4 °C’de 5 dakika santrifüjleyin. Süpernatanı dikkatlice boşaltın ve oda sıcaklığında 1 dakika boyunca 1 mL parçalama tamponu ekleyin. Parçalanma reaksiyonunu durdurmak ve süpernatanı çıkarmak için 10 mL soğuk PBS ekleyin. Süspansiyonu 500 x g’de 4 °C’de 5 dakika santrifüjleyin. Süpernatanı dikkatlice boşaltın ve 10 mL soğuk PBS ekleyin. Manuel veya otomatik hücre sayımı ile tripan mavisi lekesi ile hücre sayımı yapın. Daha fazla test için akış sitometrisi boyama ve/veya sıvı nitrojen içinde kriyorezervasyon için bir hücre peleti kullanın.