노인의 혈장에서 페놀 대사 산물의 질량 분광법 분석에 결합 된 반 표적 초고성능 크로마토그래피
Özet
이 프로토콜의 목표는 반표적 크로마토그래피-질량 분광법을 사용하여 혈장에서 페놀 대사 산물을 검출하는 것입니다.
Abstract
23 명의 노인 그룹에게 유육종 구균증 (근육 질량의 연령 관련 손실)의 예방을 위해 특별히 공식화 된 기능성 식사 (음료 및 머핀)가 주어졌습니다. 혈장 샘플은 개입의 시작과 기능성 식사를 섭취 한 30 일 후에 채취되었다. 페놀 화합물과 그 대사 산물을 확인하기 위해 탠덤 질량 (UPLC-MS/MS) 분석과 결합 된 반 표적 초고성능 크로마토그래피가 수행되었습니다. 혈장 단백질을 에탄올로 침전시키고, 샘플을 농축하고 UPLC-MS/MS 기기에 주입하기 전에 이동상(1:1 아세토니트릴: 물)에 재현탁시켰다. 분리는 C18 역상 컬럼으로 수행되었고, 화합물은 그들의 실험 질량, 동위원소 분포 및 단편 패턴을 사용하여 확인되었다. 관심있는 화합물은 데이터 뱅크 및 내부 반 표적 라이브러리의 화합물과 비교되었습니다. 예비 결과는 개입 후 확인 된 주요 대사 산물이 페닐 아세트산, 글리시틴, 3-하이드록시 페닐발레르산 및 고미신 M2임을 보여주었습니다.
Introduction
유육종증은 노인 인구의 근육 손실이 가속화되는 것과 관련된 진행성 골격 장애입니다. 이 상태는 낙상의 위험을 증가시키고 일상 생활의 제한된 활동으로 이어집니다. 사르크로니아는 65세 이상 인구의 약 5%-10%, 80세 이상의 사람의 약 50%에 존재합니다1. 유육종증 치료를 위해 특정 약물이 승인되지 않았으므로 신체 활동과 균형 잡힌 식단으로 예방하는 것이 중요합니다1,2. 유제품 단백질과 필수 아미노산이 풍부한 특수 공식화 식품에 대한 영양 개입은 유육종 감소증을 예방하는 데 긍정적 인 결과를 보여주었습니다2. 다른 연구에서, 저자들은 비타민 E와 이소플라본과 같은 비타민과 항산화제를 식단에 포함시켜 허리와 엉덩이의 근육 증가에 대한 이점을 증가시켰다3.
Brosimum alicastrum Sw. (Ramón)는 멕시코 열대 지방에서 자라는 나무입니다. 그것은 높은 영양 가치로 인해 마야 문화에 의해 소비되었습니다4. 그것은 단백질, 섬유, 미네랄 및 클로로겐산5과 같은 페놀 성 산화 방지제의 좋은 원천입니다. 분말로 분쇄하여 베이킹 제품에 사용하거나 음료에 섭취 할 수 있기 때문에 최근 연구에 따르면 라몬 종자 가루 (RSF)를 다른 식품에 혼입하여 영양 가치를 향상시키는 것으로 평가했습니다. RSF가 보충 된 카푸치노 맛의 음료가 공식화되었으며,식이 섬유가 풍부하고 서빙 당 6g 이상의 단백질을 함유하고 있으며 소비자들에게 높은 평가를 받았습니다. 따라서, 그것은 특별한식이 요구 사항을 충족하기위한 잠재적 인 대안으로 간주되었습니다6. 후속 연구에서 RSF는 머핀과 단백질,식이 섬유, 미량 영양소 및 페놀 성 항산화 물질이 풍부한 새로운 음료를 공식화하는 데에도 사용되었습니다. 머핀과 음료는 30 일 동안 하루에 두 번 두 번 섭취 한 노인을위한식이 중재에 사용되었습니다. 이 기간이 지나면 참가자의 영양 및 유육종 상태가 개선되고 혈장의 총 페놀 함량이 증가했습니다7. 그러나 혈장에서 총 페놀 화합물의 결정은 분광 광도법에 의해 수행되었으므로 흡수 된 실제 페놀 화합물의 확인은 불가능했습니다. 또한,이 방법은 페놀 화합물에 대해 완전히 특이적이지 않으므로 일부 과대 평가가 발생할 수 있습니다8.
이러한 항산화제가 풍부한 식품을 섭취한 후 흡수되는 페놀계 화합물의 동정 및 정량화는 어려운 작업이지만 이러한 파이토케미컬의 생물학적 활성을 입증하기 위해서는 필요하다. 대부분의 페놀 화합물의 생체 이용률은 낮다; 그 중 5 % 미만은 플라즈마에서 구조적 변형없이 발견 될 수 있습니다. 페놀계 화합물은 메틸화, 설폰화 또는 글루쿠로니데이션과 같은 여러 가지 생물변형을 겪으며, 이는 장세포 및 간세포에 의해 수행된다9. 페놀 화합물은 또한 미생물에 의해 박테리아 이화 물질로 생물 변환되어 혈장에 흡수 된 후 신체에서 유익한 효과를 발휘할 수 있습니다10. 예를 들어, 페닐아세트산은 플라보노이드 및 올리고머성 프로안토시아니딘의 박테리아 형질전환의 산물이며, 이는 크랜베리 섭취 후 요로에서의 박테리아(Escherichia coli) 부착을 최대 40%까지 억제할 수 있다11.
자연 발생 페놀 화합물의 구조적 다양성은 대사 산물의 다양성과 낮은 생체 이용률에 추가되어 혈장에서의 식별을 더욱 어렵게 만듭니다. 핵 자기 공명 (NMR) 및 탠덤 질량 분광법 (MS / MS)과 같은 분광학적 분석 플랫폼을 사용하는 대사 체학 프로파일 링은이 목표를 달성하기위한 최선의 방법 일 것입니다. 불행히도 장비에 쉽게 접근 할 수 없으며 분석 프로토콜 개발은 여전히 제한적입니다12. 몇몇 연구는 MS/MS가 분리 시스템(액체 크로마토그래피와 같은)과 결합되어 대사체 연구에서 질량 스펙트럼의 복잡성을 감소시키기 위한 전략이라고 보고했다. 최근 초고성능 액체 크로마토그래피(UPLC) 분리 방법이 도입됨에 따라 기존의 고성능 액체 프로토콜에 비해 분석 시간이 단축되고 분해능과 감도가 향상되어 UPLC-MS/MS 시스템은 분석 대사체학 커뮤니티에서 빠르게 널리 받아들여지고 있습니다13. 이러한 방식으로 일부 연구는 페놀 대사 산물을 조사하고 카페산, 퀘르세틴 및 페룰산의 글루쿠로니다제 유도체뿐만 아니라 크랜베리 섭취 후 개인의 혈장에서 주사기 및 바닐산의 술폰화 유도체를 검출했습니다14. 이전의 프로토콜은 혈장과 같은 생체 유체에서 페놀 화합물과 페놀 대사 산물을 발견하기위한 것입니다. 이들 프로토콜은 UV-vis 검출기(15)에 결합된 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC)에 의한 동정 및 정량화에 기초하였다. 그럼에도 불구하고 이러한 프로토콜은 절대 식별 및 정확한 정량화를 평가하기 위해 확실한 표준을 사용해야합니다. 광범위한 연구가 UPLC-MS 및 UPLC-MS / MS에 의한 생체 유체 (황산화, 글루 쿠로 니드 및 메틸화 된 형태)에서 가장 흔한 대사 산물을 확인했습니다. 그러나, 박테리아 대사산물의 상당 부분은 그들의 완전한 정보를 포함하는 데이터베이스의 부족으로 인해보고되지 않았다16. 대사 산물 식별은 대사 산물 표준의 비용과 상업적 가용성으로 인해 복잡합니다. 따라서 가장 좋은 전략은 분자 특징 정보 (m / z, 단일 동위원소 정확한 질량, 동위원소 분포 및 단편화 패턴)의 사용에 의존하여 화학적 동일성을 결정하고 폴리 폴리 페놀 풍부 섭취 후 생체 유체에서 확인 된 폴리페놀 대사 산물을 포함하는 자유롭게 이용 가능한 온라인 데이터베이스와 비교하는 비표적 또는 반 표적 MS / MS 대사 산물 분석 일 수 있습니다.12 . 페놀 화합물 및 그 대사 산물의 식별을 위해 UPLC-MS/MS 연구에 사용되는 가장 중요한 데이터베이스는 HMDB(Human Metabolome Database), LipidBlast Library, METLIN Library, PubChem, ChemSpider 및 Phenol Explorer17과 같은 기타 보완 데이터베이스입니다.
본 연구에서, RSF 함유 머핀 및 음료 소비 연구에 참여한 노인 그룹의 혈장 샘플을 분석하기 위해 반표적 UPLC-MS/MS 방법이 개발되었다7. 혈장 대사 산물의 다른 무료 온라인 데이터베이스의 데이터가 수집되어 특수 데이터베이스에 통합되었습니다. 이 데이터베이스는 장비 소프트웨어에 의해 자동으로 액세스하여 영양 개입 30 일 전후의 다섯 가지 혈장 샘플에서 폴리 페놀 대사 산물을 식별 할 수 있습니다. 이것은 유육종증의 예방을 위해 특별히 공식화 된 기능성 식품에서 흡수되는 주요 페놀 화합물 또는 그 대사 산물을 확인하기 위해 수행됩니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
식품 또는 식품 보충제를 섭취 한 후에 흡수되는 생리 활성 식물 화학 물질의 식별 및 정량화는 이러한 화합물과 그 함유 식품의 건강상의 이점을 입증하고 이해하는 데 중요합니다. 본 연구에서, UPLC-MS/MS 방법은 노인을 위해 특별히 공식화된 두 가지 식품으로 30일간의 영양 개입 후 혈장 내 농도가 증가한 주요 페놀 화합물과 그 대사 산물의 확인만을 목표로 개발되었다. 하나의 화합물이 개입 기…
Açıklamalar
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
저자는 멕시코 CONACYT (CB- 2016-01-286449) 및 UACJ-PIVA (프로젝트 313-17-16 및 335-18-13)의 재정 지원에 감사드립니다. OAMB는 박사 학위 장학금에 대해 CONACYT에 감사하고 싶습니다. UACJ의 멀티미디어 제작 사무소의 기술 지원은 감사하게 인정됩니다.
Materials
| Acetonitrile | Tedia | Al1129-001 | LC Mass spectrometry |
| Autosampler | Agilent Technologies | G4226A | 1290 Infinity series |
| C18 reverse phase column | Agilent Technologies | 959757-902 | Zorbax Eclipse plus C18 2.1×50 mm, 1.8 μm; Rapid resolution HD |
| Centrifuge | Eppendorf | 5452000018 | Mini Spin; Rotor F-45-12-11 |
| Column compartment with thermostat | Agilent Technologies | G1316C | 1290 Infinity series |
| Diode Array Detector (UV-Vis) | Agilent Technologies | G4212B | 1260 Infinity series |
| Electrospray ionnization source | Agilent Technologies | G3251B | Dual sprayer ESI source |
| Formic acid | J.T. Baker | 0128-02 | Baker reagent, ACS |
| Mass Hunter Data Acquisition | Agilent Technologies | G3338AA | |
| Mass Hunter Personal Compound Datbase and Library Manager | Agilent Technologies | G3338AA | |
| Mass Hunter Qualitative Analysis | Agilent Technologies | G3338AA | |
| Microcentrifuge tube | Brand | BR780546 | Microcentrifuge tube, 2 mL with lid |
| Pure ethanol | Sigma-Aldrich | E7023-1L | 200 proof, for molecular biology |
| Q-TOF LC/MS | Agilent Technologies | G6530B | 6530 Accurate Mass |
| Quaternary pump | Agilent Technologies | G4204A | 1290 Infinity series |
| Syringe filter | Thermo Scientific | 44514-NN | 17 mm, 0.45 μm, nylon membrane |
| Thermostat | Agilent Technologies | G1330B | 1290 Infinity series |
| Vial | Agilent Technologies | 8010-0199 | Amber, PFTE red silicone 2 mL with screw top and blue caps |
| Vial insert | Agilent Technologies | 5183-2089 | Vial insert 200 μL for 2mL standard opening, conical |
| Water | Tedia | WL2212-001 | LC Mass spectrometry |
Referanslar
- Morley, J. E., Anker, S. D., von Haehling, S. Prevalence, incidence, and clinical impact of sarcopenia: facts, numbers, and epidemiology-update 2014. Journal of Cachexia, Sarcopenia and Muscle. 5 (4), 253-259 (2014).
- Cruz-Jentoft, A. J., Sayer, A. A. Sarcopenia. The Lancet. 393 (10191), 2636-2646 (2019).
- Beaudart, C., et al. Nutrition and physical activity in the prevention and treatment of sarcopenia: systematic review. Osteoporosis International. 28 (6), 1817-1833 (2017).
- Ozer, H. K. Phenolic compositions and antioxidant activities of Maya nut (Brosimum alicastrum): Comparison with commercial nuts. International Journal of Food Properties. 20 (11), 2772-2781 (2017).
- Subiria-Cueto, R., et al. Brosimum alicastrum Sw. (Ramón): An alternative to improve the nutritional properties and functional potential of the wheat flour tortilla. Foods. 8 (12), 1-18 (2019).
- Martínez-Ruiz, N., Torres, L. E. J., del Hierro-Ochoa, J. C., Larqué-Saavedra, A. Bebida adicionada con Brosimum alicastrum sw.: Una alternativa para requerimientos dietarios especiales. Revista Salud Pública y Nutrición. 18 (3), 1-10 (2019).
- Rodríguez-Tadeo, A., et al. Functionality of bread and beverage added with brosimum alicastrum sw. Seed flour on the nutritional and health status of the elderly. Foods. 10 (8), 1-21 (2021).
- Muñoz-Bernal, &. #. 2. 1. 1. ;. A., et al. Nuevo acercamiento a la interacción del reactivo de Folin-Ciocalteu con azúcares durante la cuantificación de polifenoles totales. TIP Revista Especializada en Ciencias Químico-Biológicas. 20 (2), 28-33 (2017).
- Luca, S. V., et al. Bioactivity of dietary polyphenols: The role of metabolites. Critical Reviews in Food Science and Nutrition. 60 (4), 626-659 (2020).
- Kawabata, K., Yoshioka, Y., Terao, J. Role of intestinal microbiota in the bioavailability and physiological functions of dietary polyphenols. Molecules. 24 (2), (2019).
- de Llano, D. G., Moreno-Arribas, M. V., Bartolomé, B. Cranberry polyphenols and prevention against urinary tract Infections: Relevant considerations. Molecules. 25 (15), (2020).
- Alsaleh, M., et al. Mass spectrometry: A guide for the clinician. Journal of Clinical and Experimental Hepatology. 9 (5), 597-606 (2019).
- Wang, X., Sun, H., Zhang, A., Wang, P., Han, Y. Ultra-performance liquid chromatography coupled to mass spectrometry as a sensitive and powerful technology for metabolomic studies. Journal of Separation Science. 34 (24), 3451-3459 (2011).
- Feliciano, R. P., Mills, C. E., Istas, G., Heiss, C., Rodriguez-Mateos, A. Absorption, metabolism and excretion of cranberry (poly)phenols in humans: A dose response study and assessment of inter-individual variability. Nutrients. 9 (3), (2017).
- Mateos, R., Goya, L., Bravo, L. Uptake and metabolism of hydroxycinnamic acids (chlorogenic, caffeic, and ferulic acids) by HepG2 cells as a model of the human liver. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 54 (23), 8724-8732 (2006).
- Rodriguez Lanzi, ., Perdicaro, C., Antoniolli, D. J., Piccoli, A., Vazquez Prieto, M. A., Fontana, A. Phenolic metabolites in plasma and tissues of rats fed with a grape pomace extract as assessed by liquid chromatography-tandem mass spectrometry. Archives of Biochemistry and Biophysics. , 28-33 (2018).
- Hou, Y., He, D., Ye, L., Wang, G., Zheng, Q., Hao, H. An improved detection and identification strategy for untargeted metabolomics based on UPLC-MS. Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis. 191, 113531 (2020).
- Nagy, K., et al. First identification of dimethoxycinnamic acids in human plasma after coffee intake by liquid chromatography-mass spectrometry. Journal of Chromatography A. 1218 (3), 491-497 (2011).
- Marmet, C., Actis-Goretta, L., Renouf, M., Giuffrida, F. Quantification of phenolic acids and their methylates, glucuronides, sulfates and lactones metabolites in human plasma by LC-MS/MS after oral ingestion of soluble coffee. Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis. 88, 617-625 (2014).
- McCord, J., Strynar, M. Identifying per-and polyfluorinated chemical species with a combined targeted and non-targeted-screening high-resolution mass spectrometry workflow. Journal of Visualized Experiments. 2019 (146), 1-15 (2019).
- Muñoz-Bernal, &. #. 2. 1. 1. ;. A., et al. Phytochemical characterization and antiplatelet activity of Mexican red wines and their by-products. South African Journal of Enology and Viticulture. 42 (1), 77-90 (2021).
- Muñoz-Bernal, &. #. 2. 1. 1. ;. A. Enriquecimiento de un vino tinto con un extracto de compuestos fenólicos provenientes de orujo de uva: bioaccesibilidad, análisis sensorial y respuesta biológica. Universidad Autónoma de Ciudad Juárez. , (2021).
- Low, D. Y., et al. Data sharing in PredRet for accurate prediction of retention time: Application to plant food bioactive compounds. Food Chemistry. , 357 (2021).
- Sánchez-Patán, F., et al. Gut microbial catabolism of grape seed flavan-3-ols by human faecal microbiota. Targeted analysis of precursor compounds, intermediate metabolites and end-products. Food Chemistry. 131 (1), 337-347 (2012).
- Zhang, X., Sandhu, A., Edirisinghe, I., Burton-Freeman, B. M. Plasma and urinary (poly)phenolic profiles after 4-week red raspberry (Rubus idaeus L.) intake with or without fructo-oligosaccharide supplementation. Molecules. 25 (20), (2020).
