Semi-zielgerichtete Ultra-Hochleistungschromatographie gekoppelt mit massenspektrometrie Analyse von phenolischen Metaboliten im Plasma älterer Erwachsener

Sarkopenie ist eine fortschreitende Skeletterkrankung, die mit einem beschleunigten Muskelverlust in der älteren Bevölkerung zusammenhängt. Dieser Zustand erhöht das Sturzrisiko und führt zu eingeschränkten Aktivitäten des täglichen Lebens. Sarkopenie ist bei etwa 5%-10% der Personen über 65 Jahre und etwa 50% der Personen im Alter von 80 Jahren oder älter ^vorhanden1. Für die Behandlung von Sarkopenie wurden keine spezifischen Medikamente zugelassen, daher ist eine Prävention mit körperlicher Aktivität und einer ausgewogenen Ernährung ^wichtig1,2. Ernährungsinterventionen mit speziell formulierten Lebensmitteln, die mit Milchprotein und essentiellen Aminosäuren angereichert sind, haben positive Ergebnisse bei der Prävention von Sarkopenie ^gezeigt2. In anderen Studien haben die Autoren Vitamine und Antioxidantien wie Vitamin E und Isoflavone in die Ernährung aufgenommen, was die Vorteile für den Muskelaufbau an Taille und Hüfte ^erhöht3.

Brosimum alicastrum Sw. (Ramón) ist ein Baum, der in den mexikanischen tropischen Regionen wächst; Es wurde aufgrund seines hohen Nährwerts von ^{Maya-Kulturen konsumiert4.} Es ist eine gute Quelle für Protein, Ballaststoffe, Mineralien und phenolische Antioxidantien wie Chlorogensäure5. Da es zu Pulver gemahlen und in Backwaren verwendet oder in Getränken konsumiert werden kann, haben neuere Studien die Einarbeitung von Ramón-Samenmehl (RSF) in verschiedene Lebensmittel untersucht, um deren Nährwert zu verbessern. Es wurde ein mit RSF ergänztes Getränk mit Cappuccinogeschmack formuliert, das reich an Ballaststoffen war und mehr als 6 g Protein pro Portion enthielt und von den Verbrauchern sehr akzeptiert wurde. Daher wurde es als mögliche Alternative zur Erfüllung spezieller Ernährungsbedürfnisse ^angesehen6. In einer Folgestudie wurde RSF auch verwendet, um einen Muffin und ein neues Getränk zu formulieren, das reich an Protein, Ballaststoffen, Mikronährstoffen und phenolischen Antioxidantien ist. Der Muffin und das Getränk wurden in einer diätetischen Intervention für ältere Menschen verwendet, die beide Produkte 30 Tage lang zweimal täglich konsumierten. Nach diesem Zeitraum verbesserte sich der ernährungsphysiologische und sarkopenische Status der Teilnehmer und der Gesamtphenolgehalt des Plasmas nahm ^zu7. Die Bestimmung der gesamten phenolischen Verbindungen im Plasma wurde jedoch mit einem spektralphotometrischen Verfahren durchgeführt, so dass eine Identifizierung der tatsächlich absorbierten phenolischen Verbindungen nicht möglich war; Darüber hinaus ist diese Methode nicht vollständig spezifisch für phenolische Verbindungen, so dass eine gewisse Überschätzung auftreten ^kann8.

Die Identifizierung und Quantifizierung der phenolischen Verbindungen, die nach dem Verzehr von Lebensmitteln, die reich an diesen Antioxidantien sind, absorbiert werden, ist eine schwierige Aufgabe, aber notwendig, um die biologische Aktivität dieser sekundären Pflanzenstoffe nachzuweisen. Die Bioverfügbarkeit der meisten phenolischen Verbindungen ist gering; Weniger als 5% von ihnen können ohne strukturelle Transformation im Plasma gefunden werden. Phenolische Verbindungen durchlaufen mehrere Biotransformationen wie Methylierung, Sulfonierung oder Glucuronidierung, die von Enterozyten und Hepatozyten durchgeführt ^werden9. Phenolische Verbindungen werden auch von der Mikrobiota in bakterielle Katabolite umgewandelt, die nach der Aufnahme in das Plasma ihre wohltuende Wirkung im Körper entfalten ^können10. Zum Beispiel ist Phenylessigsäure ein Produkt der bakteriellen Umwandlung von Flavonoiden und oligomeren Proanthocyanidinen, die nach dem Cranberry-Verzehr bis zu 40% der Adhäsion von Bakterien (Escherichia coli) in den Harnwegen hemmen ^können11.

Die strukturelle Vielfalt der natürlich vorkommenden phenolischen Verbindungen, die der Vielfalt ihrer Metaboliten und ihrer geringen Bioverfügbarkeit hinzugefügt wird, macht ihre Identifizierung im Plasma noch schwieriger. Die metabolomische Profilerstellung unter Verwendung spektroskopischer Analyseplattformen wie Kernspinresonanz (NMR) und Tandem-Massenspektroskopie (MS/MS) ist wahrscheinlich der beste Ansatz, um dieses Ziel zu erreichen. Leider sind die Geräte nicht leicht zugänglich, und die Entwicklung von Analyseprotokollen ist immer noch ^begrenzt12. Mehrere Studien haben über MS/MS in Verbindung mit einem Trennsystem (z. B. Flüssigkeitschromatographie) als Strategie zur Verringerung der Komplexität von Massenspektren in metabolomischen Studien berichtet. Die jüngste Einführung von UPLC-Trennmethoden (Ultra-Hochleistungsflüssigkeitschromatographie) hat die Analysezeit verkürzt und die Auflösung und Empfindlichkeit im Vergleich zu herkömmlichen Hochleistungs-Flüssigkeitsprotokollen erhöht, so dass UPLC-MS/MS-Systeme von der analytischen Metabolomik-Community schnell akzeptiert ^wurden13. Auf diese Weise haben einige Studien phenolische Metaboliten untersucht und glucuronidierte Derivate aus Kaffeesäure, Quercetin und Ferulasäure sowie sulfonierte Derivate aus Spritz- und Vanillsäure im Plasma von Personen nach der Aufnahme von Cranberry ^{nachgewiesen14.} Frühere Protokolle haben beabsichtigt, phenolische Verbindungen und phenolische Metaboliten in Bioflüssigkeiten wie Plasma zu finden. Diese Protokolle basierten auf der Identifizierung und Quantifizierung durch Hochleistungsflüssigkeitschromatographie (HPLC), die an einen UV-Vis-Detektor gekoppelt ^war15. Solche Protokolle erfordern jedoch die Verwendung authentischer Standards, um die absolute Identifizierung und genaue Quantifizierung zu bewerten. Eine breite Palette von Studien hat die häufigsten Metaboliten in Biofluiden (sulfonierte, glucuronidierte und methylierte Formen) durch UPLC-MS und UPLC-MS/MS identifiziert; Ein großer Teil der bakteriellen Metaboliten wurde jedoch aufgrund fehlender Datenbanken, die ihre vollständigen Informationen enthalten^{, nicht gemeldet16.} Die Identifizierung von Metaboliten wird durch die Kosten und die kommerzielle Verfügbarkeit von Metabolitenstandards erschwert. Daher kann die beste Strategie eine ungezielte oder semi-zielgerichtete MS/MS-Metabolitenanalyse sein, die sich auf die Verwendung molekularer Merkmalsinformationen (m/z, monoisotopengenaue Masse, Isotopenverteilung und Fragmentierungsmuster) stützt, um die chemische Identität zu bestimmen und sie mit frei verfügbaren Online-Datenbanken zu vergleichen, die Polyphenolmetaboliten enthalten, die nach dem Verbrauch von Polypolyphenol-Richts in Biofluiden identifiziert ^wurden12 . Die wichtigsten Datenbanken, die in UPLC-MS/MS-Studien zur Identifizierung phenolischer Verbindungen und ihrer Metaboliten verwendet werden, sind die Human Metabolome Database (HMDB), die LipidBlast Library, die METLIN Library und andere ergänzende Datenbanken wie PubChem, ChemSpider und Phenol ^Explorer17.

In der vorliegenden Studie wurde eine semi-zielgerichtete UPLC-MS/MS-Methode entwickelt, um die Plasmaproben der Gruppe älterer Personen zu analysieren, die an der RSF-haltigen Muffin- und Getränkekonsumstudie beteiligt ^waren7. Daten aus verschiedenen kostenlosen Online-Datenbanken von Plasmametaboliten wurden gesammelt und in eine spezialisierte Datenbank integriert. Auf diese Datenbank kann die Gerätesoftware automatisch zugreifen, um die polyphenolischen Metaboliten in den fünf Plasmaproben vor und nach der 30-tägigen Ernährungsintervention zu identifizieren. Dies geschieht, um die wichtigsten phenolischen Verbindungen oder ihre Metaboliten zu identifizieren, die aus den speziell formulierten funktionellen Lebensmitteln zur Vorbeugung von Sarkopenie absorbiert werden.