Cromatografía semidirigida de ultra alto rendimiento acoplada al análisis de espectrometría de masas de metabolitos fenólicos en plasma de adultos mayores

La sarcopenia es un trastorno esquelético progresivo relacionado con una pérdida acelerada de músculo en la población de edad avanzada. Esta condición aumenta el riesgo de caídas y conduce a actividades limitadas de la vida diaria. La sarcopenia está presente en aproximadamente el 5%-10% de las personas mayores de 65 años y alrededor del 50% de las personas de 80 años o ^más1. No se han aprobado fármacos específicos para el tratamiento de la sarcopenia, por lo que la prevención con actividad física y una dieta equilibrada es ^{importante1,2}. Las intervenciones nutricionales con alimentos especialmente formulados enriquecidos con proteína láctea y aminoácidos esenciales han mostrado resultados positivos en la prevención de la sarcopenia2. En otros estudios, los autores han incluido vitaminas y antioxidantes, como la vitamina E y las isoflavonas, en la dieta, aumentando los beneficios para la ganancia muscular en la cintura y las ^caderas3.

Brosimum alicastrum Sw. (Ramón) es un árbol que crece en las regiones tropicales mexicanas; ha sido consumido por los cultivos mayas debido a su alto valor ^nutricional4. Es una buena fuente de proteínas, fibra, minerales y antioxidantes fenólicos, como el ácido ^{clorogénico5}. Dado que puede ser molido en polvo y utilizado en productos de panadería o consumido en bebidas, estudios recientes han evaluado la incorporación de harina de semilla de Ramón (RSF) en diferentes alimentos para mejorar su valor nutricional. Se formuló una bebida con sabor a capuchino suplementada con RSF, que era alta en fibra dietética y tenía más de 6 g de proteína por porción, y fue altamente aceptada por los consumidores; por lo tanto, se consideró una alternativa potencial para satisfacer necesidades dietéticas ^especiales6. En un estudio de seguimiento, RSF también se utilizó para formular un muffin y una nueva bebida rica en proteínas, fibra dietética, micronutrientes y antioxidantes fenólicos. El muffin y la bebida se utilizaron en una intervención dietética para personas mayores, que consumieron ambos productos dos veces al día durante 30 días. Después de este período, el estado nutricional y sarcopénico de los participantes mejoró, y el contenido fenólico total de plasma ^aumentó7. Sin embargo, la determinación de los compuestos fenólicos totales en plasma se llevó a cabo por un método espectrofotométrico, por lo que no fue posible la identificación de los compuestos fenólicos reales que se absorbieron; además, este método no es completamente específico para los compuestos fenólicos, por lo que puede producirse cierta sobreestimación8.

La identificación y cuantificación de los compuestos fenólicos que se absorben después del consumo de alimentos ricos en estos antioxidantes es una tarea difícil pero es necesaria para demostrar la actividad biológica de estos fitoquímicos. La biodisponibilidad de la mayoría de los compuestos fenólicos es baja; menos del 5% de ellos se pueden encontrar sin transformación estructural en plasma. Los compuestos fenólicos sufren varias biotransformaciones, como la metilación, la sulfonación o la glucuronidación, que son llevadas a cabo por enterocitos y ^hepatocitos9. Los compuestos fenólicos también son biotransformados por la microbiota en catabolitos bacterianos que pueden ejercer sus efectos beneficiosos en el cuerpo después de ser absorbidos por el ^plasma10. Por ejemplo, el ácido fenilacético es un producto de la transformación bacteriana de flavonoides y proantocianidinas oligoméricas, que pueden inhibir hasta el 40% de la adhesión de bacterias (Escherichia coli) en el tracto urinario después del consumo de ^arándano11.

La diversidad estructural de los compuestos fenólicos naturales, sumada a la diversidad de sus metabolitos y su baja biodisponibilidad, hace que su identificación en plasma sea aún más difícil. El perfil metabolómico, utilizando plataformas de análisis espectroscópico como la resonancia magnética nuclear (RMN) y la espectroscopia de masas en tándem (MS / MS), es probablemente el mejor enfoque para lograr este objetivo; desafortunadamente, el equipo no es de fácil acceso, y el desarrollo de protocolos de análisis aún es ^limitado12. Varios estudios han reportado EM / EM junto con un sistema de separación (como la cromatografía líquida) como una estrategia para reducir la complejidad de los espectros de masas en estudios metabolómicos. La reciente introducción de métodos de separación por cromatografía líquida (UPLC) de ultra alto rendimiento ha reducido el tiempo de análisis y ha aumentado la resolución y la sensibilidad en comparación con los protocolos líquidos convencionales de alto rendimiento, por lo que los sistemas UPLC-MS/MS han sido rápidamente ampliamente aceptados por la comunidad de metabolómica ^analítica13. De esta manera, algunos estudios han investigado metabolitos fenólicos y detectado derivados glucuronidados del ácido cafeico, quercetina y ácido ferúlico, así como derivados sulfonados del ácido siríngrico y vanílico en el plasma de individuos después de la ingesta de ^arándano14. Los protocolos anteriores han destinado a encontrar compuestos fenólicos y metabolitos fenólicos en biofluidos como el plasma. Estos protocolos se basaron en la identificación y cuantificación mediante cromatografía líquida de alto rendimiento (HPLC) acoplada a un detector ^UV-vis15. Sin embargo, tales protocolos requieren el uso de estándares auténticos para evaluar la identificación absoluta y la cuantificación precisa. Una amplia gama de estudios han identificado los metabolitos más comunes en los biofluidos (formas sulfonadas, glucuronidas y metiladas) por UPLC-MS y UPLC-MS/MS; sin embargo, gran parte de los metabolitos bacterianos no ha sido reportado debido a la falta de bases de datos que contengan su información ^completa16. La identificación de metabolitos se complica por el costo y la disponibilidad comercial de los estándares de metabolitos. Por lo tanto, la mejor estrategia puede ser el análisis de metabolitos MS/MS no dirigido o semidirigido, que se basa en el uso de información de características moleculares (m/z, masa exacta monoisotópica, distribución isotópica y patrón de fragmentación) para determinar la identidad química y compararla con bases de datos en línea disponibles gratuitamente que contienen metabolitos de polifenoles identificados en biofluidos después del consumo de ricos en polipolifenoles12 . Las bases de datos más importantes utilizadas en los estudios UPLC-MS/MS para la identificación de compuestos fenólicos y sus metabolitos son la Human Metabolome Database (HMDB), LipidBlast Library, METLIN Library y otras bases de datos complementarias, como PubChem, ChemSpider y Phenol ^Explorer17.

En el presente estudio, se desarrolló un método semi-dirigido UPLC-MS/MS para analizar las muestras plasmáticas del grupo de ancianos involucrados en el estudio de consumo de magdalenas y bebidas que contenía ^RSF7. Los datos de diferentes bases de datos gratuitas en línea de metabolitos plasmáticos se recopilaron e integraron en una base de datos especializada. El software del equipo puede acceder automáticamente a esta base de datos para identificar los metabolitos polifenólicos en las cinco muestras de plasma antes y después de la intervención nutricional de 30 días. Esto se hace para identificar los principales compuestos fenólicos, o sus metabolitos, que se absorben de los alimentos funcionales especialmente formulados diseñados para la prevención de la sarcopenia.